HIV-1患者體內(nèi)膜蛋白序列變異與廣譜中和抗體產(chǎn)生關(guān)系的研究.pdf

1、自1981年HIV-1被首次發(fā)現(xiàn)，并于1984年確定為獲得性免疫缺陷綜合癥的病原體以來，艾滋病已成為嚴(yán)重威脅人類健康的公共衛(wèi)生問題。真正控制乃至消除艾滋病的理想途徑是有效疫苗的研發(fā)和應(yīng)用。目前大多數(shù)成功疫苗都是通過誘導(dǎo)有效的中和抗體來保護(hù)機(jī)體免受感染的，例如乙肝（HBV）疫苗、人乳頭瘤病毒（HPV）疫苗、流感疫苗等[1]。HIV的膜蛋白(Env)位于病毒顆粒表面，是中和抗體的唯一作用靶位。然而，由于HIV膜蛋白基因的易變性和低免疫原性，

2、迄今為止還沒有疫苗能在體內(nèi)誘導(dǎo)有效中和抗體。在HIV自然感染過程中，15％～25%的患者可以產(chǎn)生廣譜中和抗體，雖然這類抗體不能清除患者體內(nèi)的病毒，但能在體外中和目前已分離的大部分病毒株。對(duì)于HIV患者體內(nèi)該類抗體產(chǎn)生過程和機(jī)制的研究，將會(huì)對(duì)HIV疫苗設(shè)計(jì)，特別是基于中和抗體的疫苗設(shè)計(jì)有很好的指導(dǎo)意義。
　　本課題首先用假病毒中和試驗(yàn)對(duì) HIV患者血漿樣本進(jìn)行檢測，檢測樣本為來自我國北京的HIV-1陽性的MSM人群，共75份，包括我

3、國流行的三個(gè)主要亞型：B’、BC和AE亞型，感染時(shí)間一年半以上，血漿檢測所用假病毒為：SC19-15（BC亞型）、S91-2（AE亞型）、SF162（B亞型）和 M1-27（B’亞型），并以 VSV假病毒作為對(duì)照，排除血漿的非特異反應(yīng)?；谥泻椭辽賰煞N類型的假病毒，AE亞型血漿的中和活性最高，達(dá)53%（20/38）；BC亞型和B’亞型血漿分別占27%（3/11）和23%（6/26）。從中，我們選擇了9份中和效力和中和廣譜性較好的HIV

4、AE亞型患者樣本：YA141（B）、YA155（C）、YA165（D）、YA086（E）、YA087（F）、YA099（G）、YA093（H）、YA218（I）和YA223（J），同時(shí)選擇了1份未產(chǎn)生中和抗體的樣本YA132（A）。對(duì)上述10位患者從最初感染至感染一年半之后的系列血漿樣本進(jìn)行中和抗體檢測，所選假病毒為較難中和的CRF01_AE亞型假病毒，包括：GX24.8、GX71.18、BJ5.11和SHX346.6。發(fā)現(xiàn)4位患者D、

5、E、F和I能夠中和多株病毒，產(chǎn)生了亞型內(nèi)的交叉保護(hù)中和抗體，其中E患者中和廣譜性和中和抗體滴度最好。因此，我們將YA086（E）和YA132（A）分別作為產(chǎn)生和未產(chǎn)生廣譜中和抗體的兩類患者進(jìn)行后續(xù)分析。
　　我們構(gòu)建了YA086（E）和YA132（A）兩位患者不同時(shí)間點(diǎn)的膜蛋白準(zhǔn)種庫，分別為E2、E5、E7、E9、E10和A2、A6、A8、A11，每兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的時(shí)間間隔約為30周。對(duì)其序列分析，發(fā)現(xiàn)E患者相對(duì)于A患者有更高的序列多

6、樣化（p<0.05）及離散程度。
　　接下來，用已知單克隆抗體對(duì)兩位患者的系列假病毒進(jìn)行中和，得出兩位患者的病毒株對(duì)單抗2F5、4E10、2G12和b12的中和無區(qū)別，所有被測假病毒均對(duì)2F5和4E10敏感，對(duì)2G12和b12耐受；然而，E患者的絕大部分毒株和A患者的所有被測毒株均對(duì)PG9/16敏感，僅極少數(shù)E患者毒株對(duì)其耐受。序列分析表明，毒株對(duì)PG9/16的耐受可能與H173Q突變有關(guān)。
　　從不同時(shí)間點(diǎn)血漿對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)

7、假病毒的中和反應(yīng)得出，隨感染時(shí)間延長，E和A患者中和抗體滴度均上升，但E患者比A患者有更強(qiáng)的自體中和抗體反應(yīng)，且出現(xiàn)的更早、更快。此外，E患者自體中和抗體反應(yīng)形成的動(dòng)態(tài)變化和該患者基因多樣性的動(dòng)態(tài)變化一致，且二者均在最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)達(dá)到峰值，說明了中和抗體和病毒是共同進(jìn)化的，即中和抗體的產(chǎn)生依賴于病毒膜蛋白的不斷變異，變異的膜蛋白誘導(dǎo)新的抗體，新的抗體又催生膜蛋白新的變異，在這樣相互作用與往復(fù)積累的過程中，抗體不斷成熟，最后發(fā)展成為廣譜中

8、和抗體。
　　為了尋找與E患者體內(nèi)廣譜中和抗體產(chǎn)生相關(guān)的分子因素，在E患者中挑選出一株敏感株（E2-13）和一株耐受株（E10-3），對(duì)其C1C3區(qū)、C1V3區(qū)、V1C3區(qū)、C1V2區(qū)、V1V3區(qū)、V1V2+C3區(qū)、V1V2區(qū)和C3區(qū)進(jìn)行相互的嵌合突變，并用E患者最后時(shí)間點(diǎn)的血漿（E10）進(jìn)行中和，發(fā)現(xiàn)E10對(duì)E2-13(E10-3 C1C3)和 E10-3(E2-13 C1C3)中和滴度與其對(duì)原始株 E10-3和 E2-13無差

9、異，因此得出C1C3區(qū)的序列變化是E患者廣譜中和抗體產(chǎn)生的重要貢獻(xiàn)者。接著，對(duì)E患者系列時(shí)間點(diǎn) C1C3區(qū)的序列縱向分析，發(fā)現(xiàn)最初和最末時(shí)間點(diǎn)間存在8個(gè)位點(diǎn)的突變，即Q85P、146NITDEVKIG、H183P、K340E、354N、L364S、L368I和I371V。我們進(jìn)一步構(gòu)建了E2-13（E10-38個(gè)位點(diǎn)）和E10-3（E2-138個(gè)位點(diǎn)）嵌合株，前者對(duì)E10血漿的敏感性降低，后者敏感性升高，但均未降低和升高到其對(duì)原始株E1

10、0-3和E2-13的水平，說明這8個(gè)突變位點(diǎn)在廣譜中和抗體產(chǎn)生中發(fā)揮了關(guān)鍵但不完全的作用。
　　同時(shí)，模擬患者體內(nèi)病毒變異情況，利用制備的HIV-1膜蛋白質(zhì)粒準(zhǔn)種庫，采用電穿孔的方式對(duì)豚鼠進(jìn)行序列免疫，未成功誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生。
　　本課題基于對(duì)產(chǎn)生與未產(chǎn)生廣譜中和抗體患者的分子與免疫學(xué)特征比較，得出廣譜中和抗體的產(chǎn)生是自體中和抗體與病毒基因多樣化相互作用的結(jié)果。并進(jìn)一步通過對(duì)產(chǎn)生廣譜中和抗體患者體內(nèi)敏感株與耐受株的改造，發(fā)現(xiàn)