靶向抑制自噬關(guān)鍵蛋白Beclin1對(duì)HCMV潛伏感染的影響.pdf

1、目的:人巨細(xì)胞病毒(HCMV)屬于皰疹病毒β亞科，人群普遍易感，在成年人中的感染率高達(dá)90％，而我國孕婦的感染率更高，達(dá)95％以上。雖然HCMV原發(fā)性感染在個(gè)體免疫功能健全時(shí)并不引起臨床癥狀，但初次感染后可在體內(nèi)建立潛伏感染，待宿主免疫功能受限時(shí)，可導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床后果，如肝炎，腦炎乃至死亡。更為重要的是，在先天性感染中，大約10％～15％被感染的新生兒有臨床癥狀，表現(xiàn)為黃疸型肝炎、肝脾腫大、肺炎等嚴(yán)重的臨床后果。而在無癥狀的患兒中，10

2、％～17％會(huì)發(fā)展為耳聾或者神經(jīng)發(fā)育異常。自噬(autophagy)是一種由溶酶體介導(dǎo)將體內(nèi)衰老的細(xì)胞器或者錯(cuò)誤折疊的蛋白降解成小分子氨基酸的降解通路。它不僅可以抵御病原體的侵襲，還通過為細(xì)胞提供能源來維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。近年來，關(guān)于HCMV與自噬的關(guān)系的研究也日趨增多，并取得了階段性的進(jìn)展。但這些研究都是在HCMV增殖感染模型上進(jìn)行的，目前有關(guān)自噬水平變化與HCMV潛伏感染的關(guān)系尚無文獻(xiàn)報(bào)道。明確自噬水平變化對(duì)HCMV潛伏感染的影響，

3、有助于了解HCMV潛伏感染的機(jī)制，并為臨床HCMV的預(yù)防與治療提供新的思路。
　　方法:本研究包括兩部分內(nèi)容:
　　(1)建立HCMV潛伏感染模型:用HCMV Towne株感染人急性單核白血病細(xì)胞（human acute monocytic leukaemia cell line，THP-1）作為實(shí)驗(yàn)組，以未感染的THP-1細(xì)胞作為空白對(duì)照組，在感染后1d、3d、5d、7d、9d時(shí)，去除培養(yǎng)液，并收集細(xì)胞。提取細(xì)胞內(nèi)的DNA

4、，熒光定量檢測(cè)THP-1細(xì)胞內(nèi)HCMV DNA拷貝數(shù);Trizol法提取細(xì)胞總RNA后，RT-PCR檢測(cè)HCMV UL122、UL123和UL138基因的表達(dá)水平;RIPA裂解液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白后，western blot檢測(cè)HCMV IE蛋白和UL138蛋白表達(dá)水平。確定是否建立了HCMV潛伏感染模型。
　　(2)靶向抑制自噬關(guān)鍵蛋白Beclin1對(duì)HCMV潛伏感染的影響:構(gòu)建Beclin1的干擾慢病毒載體，并篩選出有效

5、的干擾慢病毒載體及作用濃度。以HCMV Towne株感染THP-1細(xì)胞作為陰性對(duì)照組，以HCMV Towne株+空白載體轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞作為空白對(duì)照組，以HCMV Towne株+Beclin1干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染THP-1細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，并從透射電鏡觀察自噬體數(shù)量的變化、RT-PCR檢測(cè)Beclin1、Atg5、Atg7、LC3、UL122、UL123、UL138 mRNA水平，以及western blot檢測(cè)Beclin1、Atg5、

6、Atg7、LC3、IE、UL138蛋白水平這三個(gè)方面了解Beclin1干擾慢病毒載體是否引起細(xì)胞自噬水平的變化以及自噬水平變化后對(duì)HCMV潛伏感染狀態(tài)的影響。
　　結(jié)果:成功建立了HCMV潛伏感染的模型。熒光定量PCR來檢測(cè)HCMV DNA的拷貝數(shù)，其結(jié)果表明:HCMV Towne株感染THP-1細(xì)胞1d、3d、5d，HCMV DNA拷貝數(shù)逐漸增加，感染5d、7d、9d，DNA拷貝數(shù)逐漸減少;RT-PCR的結(jié)果顯示:HCMVTow

7、ne株感染THP-1細(xì)胞后，在感染早期有HCMV即刻早期IE基因(UL122、UL123)的表達(dá)，UL122基因mRNA水平在感染后的1d、3d均有表達(dá)，5d后基本不表達(dá);UL123基因mRNA表達(dá)水平則不明顯;在感染早期，潛伏相關(guān)基因UL138 mRNA的表達(dá)水平則不明顯;隨著感染時(shí)間的延長，HCMV UL138基因逐漸表達(dá)增加。Western blot的結(jié)果表明:HCMV Towne株感染THP-1細(xì)胞后，IE蛋白在感染后1d、3d

8、有表達(dá)，而感染5d后未檢測(cè)到IE蛋白的表達(dá)，但UL138蛋白則持續(xù)表達(dá)。
　　透射電鏡結(jié)果顯示:在非連續(xù)區(qū)域，隨機(jī)選取5個(gè)細(xì)胞，正常THP-1細(xì)胞組平均每個(gè)細(xì)胞自噬體的數(shù)量為3個(gè)，不轉(zhuǎn)染慢病毒載體組10個(gè)，轉(zhuǎn)染GV248空白載體組9個(gè)，轉(zhuǎn)染GV248-Beclin1-9244組6個(gè);Beclin1干擾慢病毒載體轉(zhuǎn)染后，與正常THP-1細(xì)胞相比，自噬體數(shù)量是增加的;但與不轉(zhuǎn)染慢病毒載體組以及轉(zhuǎn)染GV248空白載體組相比，自噬小體數(shù)量

9、是減少的，因此，轉(zhuǎn)染Beclin1干擾慢病毒載體后自噬體數(shù)量有所減少。與陰性對(duì)照組組及空白對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的自噬相關(guān)基因Beclin1、Atg5、Atg7和LC3的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平明顯減少，而與病毒復(fù)制和潛伏相關(guān)基因UL122和UL138的轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平并無明顯變化。熒光定量PCR檢測(cè)HCMV DNA拷貝數(shù)結(jié)果顯示:與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組相比，在未建立潛伏感染時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的HCMV DNA拷貝數(shù)在第5d時(shí)下降較明顯，而在潛伏感染