IL-17A對SiO2誘導(dǎo)小鼠巨噬-淋巴共培養(yǎng)細(xì)胞Th應(yīng)答影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、吸入含有游離性二氧化硅的粉塵可以導(dǎo)致矽肺，它以肺部慢性炎癥和纖維化為主要病理改變[1]。游離二氧化硅在自然界中分布極廣，它是許多巖石和礦石的組成成分，因此接觸二氧化硅的作業(yè)也是分布廣泛的。雖然我國在控制游離性二氧化硅粉塵的產(chǎn)生和擴(kuò)散、降低作業(yè)場所二氧化硅粉塵濃度、改善勞動環(huán)境方面做了大量工作，而且已取得了一定的成績，但其危害的形勢依然嚴(yán)峻。因此，進(jìn)行二氧化硅所誘導(dǎo)炎癥的研究對矽肺的預(yù)防和治療具有重要的指導(dǎo)意義。
　　 二氧化硅顆

2、粒進(jìn)入肺組織后，首先接觸的是肺泡巨噬細(xì)胞。它可以通過細(xì)胞表面所表達(dá)的受體MARCO識別并吞噬游離性二氧化硅粉塵。經(jīng)過二氧化硅刺激的巨噬細(xì)胞一方面釋放前炎性因子IL-1β，TNF-a等，另一方面作為抗原提呈細(xì)胞調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞釋放IL-4，IL-13，IFN-γ等效應(yīng)因子。動物實(shí)驗(yàn)證明，在SiO2誘導(dǎo)的肺部炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮主要作用的輔助性T細(xì)胞是CD4+T細(xì)胞。CD4+T細(xì)胞可以分化為Th1，Th2，Treg和Th1

3、7細(xì)胞。炎癥早期的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞主要是Th1型細(xì)胞，隨著疾病發(fā)展進(jìn)入纖維化反應(yīng)期后，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞發(fā)生Th2型細(xì)胞極化。而Th1和Th2型免疫反應(yīng)之間存在抑制平衡的現(xiàn)象，這種平衡受到Treg細(xì)胞的調(diào)控。Th17細(xì)胞是新近發(fā)現(xiàn)的一種細(xì)胞類型，分泌IL-17A、IL-17F，IL-21、IL-22等細(xì)胞因子，并特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子ROR-γt。Th17細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)性矽肺的早期炎癥階段發(fā)揮促炎作用，其分化受到細(xì)胞因子TGF-β，IL-6，IL-1

4、β和/或IL-23的調(diào)節(jié)。IL-17A是Th17細(xì)胞的主要效應(yīng)因子，能誘導(dǎo)IL-1β，IL-6等細(xì)胞因子的分泌，起到促進(jìn)炎癥發(fā)展的作用。IL-17A的抗體(anti-IL-17A mAb)能中和掉IL-17A達(dá)到抑制其功能的作用，除此之外，阻滯Th17分化過程中的關(guān)鍵因子也能削弱IL-17A的功能。IL-1Ra(Anakinra)能與IL-1β競爭結(jié)合IL-1受體，而不啟動胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活細(xì)胞，從而抑制IL-1β的生物學(xué)作用。IL-

5、1β能促進(jìn)Th17的分化。因此，IL-1受體阻滯劑和IL-17A抗體都能影響IL-17A的分泌和功能。
　　 當(dāng)肺巨噬細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞從體內(nèi)提取出來，建立體外培養(yǎng)體系并給與不同的處理因素后，Th1，Th2，Treg，Th17及其相關(guān)細(xì)胞因子的分泌和表達(dá)情況是如何變化的？IL-17A對Th1/Th2免疫應(yīng)答以及Th17與Treg之間的平衡的影響如何？IL-17A水平的降低對Th17細(xì)胞的分化有何作用？為回答上述問題，我們擬利用C5

6、7BL/6小鼠獲取肺泡巨噬細(xì)胞和脾淋巴細(xì)胞，建立體外培養(yǎng)體系，并體外給予PBS，SiO2，SiO2加IL-1受體阻滯劑和SiO2加IL-17A抗體的不同處理。然后在不同時間點(diǎn)獲得上清液和兩種細(xì)胞，檢測各種細(xì)胞因子的分泌和表達(dá)情況。以期能為探明矽肺發(fā)病免疫學(xué)機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 實(shí)驗(yàn)方法：
　　 一、動物和細(xì)胞的準(zhǔn)備
　　 C57BL/6小鼠（6-8周齡，雌性）適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，腹腔注射苯巴比妥鈉麻醉后，用

7、非暴露方式進(jìn)行氣管的PBS灌注，每只小鼠灌注80μlPBS，目的是刺激肺部產(chǎn)生更多的巨噬細(xì)胞。
　　 二、獲取小鼠巨噬細(xì)胞
　　 經(jīng)PBS灌注的C57BL/6小鼠于第3天處死，采用頸椎脫位法。取小鼠仰臥位，自下腹部剪開胸腔，游離肺臟及氣管。用14號針頭插入氣管腔內(nèi)，并用縫線固定，行氣管肺泡灌洗，將1ml PBS緩慢注入肺內(nèi)，間隔30秒后，將其抽回，收集支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagenuld，

8、BALF)，多次回收，總共得到大約6ml灌洗液。1500 rpm離心8分鐘。收集細(xì)胞，取少量進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，剩余細(xì)胞用培養(yǎng)基將細(xì)胞的終濃度調(diào)至2×105，備用。
　　 三、獲取小鼠淋巴細(xì)胞
　　 小鼠處死后，將胸部及腹部皮膚酒精消毒后，取右側(cè)臥位，剪開下腹部皮膚及肌肉組織，取出脾臟，用PBS沖洗幾遍，轉(zhuǎn)移到高壓過的35 mm平皿中，加入4-5ml淋巴細(xì)胞分離液，200目不銹鋼網(wǎng)上研磨，小心收集洗液，切勿顛倒。收集到15ml

9、離心管中，液體表面小心滴加200-500μl混合培養(yǎng)基。2000rpm離心30分鐘，離心后收集淋巴細(xì)胞層的細(xì)胞到新的離心管，然后用混合培養(yǎng)基清洗一遍后計(jì)數(shù)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107，備用。
　　 四、體外共培養(yǎng)體系的建立
　　 將巨噬細(xì)胞分為4組:對照組，二氧化硅組，IL-1受體阻滯劑組和IL-17A抗體組。每組有2毫升的巨噬細(xì)胞懸液，IL-1受體阻滯劑組和IL-17A抗體組的巨噬細(xì)胞分別給予30μgIL-1受體阻滯

10、劑或40μgIL-17A抗體的處理，并360度翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)15分鐘。其他兩組給予PBS的平行對照處理。翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)15分鐘后，在對照組加入16μl PBS，其他三組分別加入16μl SiO2懸浮液（5mg/ml）。四個組的巨噬細(xì)胞繼續(xù)翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)45分鐘，然后移入12-孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，37℃和5％ CO2條件下培養(yǎng)2小時，并允許其貼壁。淋巴細(xì)胞也分為4個組:對照組，二氧化硅組，IL-1受體阻滯劑組和IL-17A抗體組。每組有2毫升的淋巴細(xì)胞懸液，I

11、L-1受體阻滯劑組和IL-17A抗體組的淋巴細(xì)胞分別給予60μg IL-1受體阻滯劑或80μg IL-17A抗體的處理，37℃和5％ CO2條件下培養(yǎng)30分鐘。其他兩組給予PBS的平行處理。巨噬細(xì)胞培養(yǎng)2小時后，小心地吸取上清棄掉，然后將預(yù)處理過的淋巴細(xì)胞一一對應(yīng)地加入巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)孔中進(jìn)行共培養(yǎng)。最終保證每組有2(×)105個巨噬細(xì)胞和1(×)107個淋巴細(xì)胞。四個組的處理?xiàng)l件分別為:PBS，SiO2(40μg)，SiO2(40μg)

12、加IL-1受體阻滯劑（15μg/ml）和SiO2(40μg)加IL-17A抗體（20μg/ml）。培養(yǎng)條件為37℃和5％CO2。
　　 在共培養(yǎng)24小時和48小時后，將培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液和細(xì)胞吸出到1.5ml EP管中，1500r/min，4℃，離心8min，上清液置入新管留做ELISA，下層細(xì)胞層加入Trizol防止RNA降解留做realtime RT-PCR。放入-70℃保存。
　　 五、EL I SA方法檢測細(xì)胞因子

13、的分泌水平
　　 在ELISA試劑板中每孔加入100μl包被抗體，冰箱4℃過夜。次日，棄液洗滌。每孔加200μl檢測緩沖液室溫孵育1h。加一定稀釋的待檢樣品及標(biāo)準(zhǔn)品100μl于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37℃孵育2小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。于各反應(yīng)孔中，加入100μl檢測抗體室溫孵育1h，洗滌。室溫加入100μl酶孵育30 min。不洗滌直接加入100μl底物顯色15分鐘左右。于各反應(yīng)孔中加入50μ

14、l反應(yīng)終止液。可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果:反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺。在ELISA檢測儀上，于450nm處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔OD值。每個樣品設(shè)3個平行孔。ELISA方法檢測培養(yǎng)液上清中Th1型細(xì)胞因子IL-2和IFN-γ，Th2型細(xì)胞因子IL-4，Th17型細(xì)胞因子IL-17A，抑制性細(xì)胞因子IL-10和TGF-β，以及Th17細(xì)胞分化相關(guān)細(xì)胞因子IL-6，IL-23，IL-1β的分泌水平。

15、r>　　 六、Real-time PCR方法檢測轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平
　　 在淋巴細(xì)胞層加入1ml Trizol試劑，冰浴勻漿，12000rpm離心10分鐘，將上清轉(zhuǎn)移至新管中，室溫靜置5分鐘;每管加入200μl氯仿，用力震蕩15秒，室溫靜置2-3分鐘;4℃，12000rpm，離心15分鐘;從每管中吸取上清至另一新的1.5mlEP管。加入等體積-20℃預(yù)冷的0.5ml異丙醇，混勻后室溫沉淀10分鐘;4℃，12000rpm離心10

16、分鐘后，棄上清;加入4℃預(yù)冷的75％乙醇，洗滌沉淀及離心管壁;4℃，7500rpm離心5分鐘，棄上清;室溫干燥5-10分鐘;加入10μl Rnase-free水，至完全溶解，測定RNA濃度并調(diào)整至1μg/μl。參照試劑盒操作說明書，將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，-20℃保存。PCR反應(yīng)采用SYBR Green和Taqman兩種方法，分別按照說評說在反應(yīng)管中加入混合反應(yīng)液，再加入適量樣品。在ABI7500儀器上按下列條件進(jìn)行反應(yīng):90℃30秒

17、，之后每一步變性95℃5秒，退火延伸60℃34秒，共進(jìn)行40個循環(huán)。SYBR Green方法用于檢測T-bet，GATA-3，F(xiàn)oxp3，ROR-γt和IL-23的mRNA表達(dá)水平，TaqMan方法用于檢測IL-2，IFN-γ，IL-4，IL-10，TGF-β1，IL-17A，IL-1beta，IL-6和GAPDH的mRNA表達(dá)水平。
　　 七、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 全部數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表

18、示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。采用單因素方差分析比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，當(dāng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時，用SNK法進(jìn)行組間比較，p＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 一、阻斷IL-1信號通路或中和IL-17A有效降低IL-17A的分泌
　　 ELISA和Realtime-PCR的方法用于檢測巨噬-淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系中IL-17A的分泌和mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，二氧化硅組的IL-17A分泌和mRNA表達(dá)都高于對照組，差異

19、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與二氧化硅組相比，IL-1受體阻滯劑組和IL-17A抗體組的IL-17A分泌水平都大幅下降，甚至比對照組更低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。IL-1受體阻滯劑組的IL-17A mRNA表達(dá)水平顯著低于二氧化硅組，而IL-17A抗體組與二氧化硅組的IL-17AmRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異。
　　 二、阻斷IL-1信號通路或中和IL-17A可以抑制Th1反應(yīng)
　　 IFN-γ和IL-2是Th1細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子。經(jīng)二氧

20、化硅刺激后，IFN-γ和IL-2的分泌和mRNA表達(dá)水平都顯著升高。而與二氧化硅組相比，IL-1受體阻滯劑組和IL-17A抗體組的IFN-γ和IL-2的分泌和mRNA表達(dá)水平都顯著降低。T-bet是Th1細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子。二氧化硅組比對照組表達(dá)更高水平的T-bet,而IL-1受體阻滯劑組和IL-17A抗體組表達(dá)的T-bet水平要低于二氧化硅組，差異在48小時有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明在巨噬-淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，阻斷IL-1信號通路或中和

21、IL-17A能抑制Th1反應(yīng)。
　　 三、阻斷IL-1信號通路或中和IL-17A可以促進(jìn)Th2反應(yīng)
　　 IL-4是Th2細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子。經(jīng)二氧化硅刺激后，IL-4的分泌和mRNA表達(dá)水平都顯著升高。與二氧化硅組相比，IL-1受體阻滯劑組和IL-17A抗體組的IL-4的分泌和mRNA表達(dá)水平都顯著升高。GATA-3是Th2細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子。二氧化硅組比對照組表達(dá)更高水平的GATA-3。IL-1受體阻滯劑組和I

22、L-17A抗體組的T-bet表達(dá)水平高于二氧化硅組，差異在48小時有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明在巨噬-淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，阻斷IL-1信號通路或中和IL-17A能促進(jìn)Th2反應(yīng)。
　　 四、阻斷IL-1信號通路或中和IL-17A可以增強(qiáng)Treg功能
　　 二氧化硅組的IL-10分泌和mRNA表達(dá)水平顯著高于對照組，而IL-1受體阻滯劑組和IL-17A抗體組的IL-10分泌和mRNA表達(dá)水平比二氧化硅組更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然

23、而各組之間TGF-β的水平?jīng)]有顯著差異。Foxp3是Treg細(xì)胞的特異性轉(zhuǎn)錄因子。與二氧化硅組相比，IL-1受體阻滯劑組和IL-17A抗體組的Foxp3表達(dá)水平在兩個時間點(diǎn)都顯著升高。這表明在巨噬-淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)體系中，阻斷IL-1信號通路或中和IL-17A能促進(jìn)Treg反應(yīng)。
　　 五、阻斷IL-1信號通路可以抑制IL-17A的表達(dá)，影響Th17細(xì)胞的分化
　　 IL-1受體阻滯劑的應(yīng)用顯著降低了IL-17A的mRNA

24、表達(dá)水平，這表明阻斷IL-1信號通路可以抑制IL-17A的mRNA表達(dá)。IL-6，TGF-β，IL-1和IL-23是與Th17細(xì)胞分化密切相關(guān)的因子，它們的檢測結(jié)果顯示，培養(yǎng)48小時后，IL-1受體阻滯劑組IL-6分泌和mRNA表達(dá)水平顯著低于二氧化硅組。TGF-β的水平?jīng)]有顯著改變。然而L-1受體阻滯劑的處理卻顯著上調(diào)了IL-1β和IL-23的分泌，其中只有IL-1受體阻滯劑組的IL-23 mRNA表達(dá)水平明顯升高，并且兩個時間點(diǎn)的差