IL-17A對哮喘氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥的影響及其免疫機(jī)制研究.pdf

1、支氣管哮喘（以下簡稱“哮喘”）是一種具有明顯異質(zhì)性的慢性氣道炎癥性疾病。哮喘具有可逆性的氣流受限、氣道高反應(yīng)性和慢性氣道炎癥等臨床特征。根據(jù)哮喘的臨床特征不同可以分為不同的臨床表型，如過敏性和非過敏性哮喘等等。不同臨床表型的哮喘其發(fā)病機(jī)制也有所不同，即存在“哮喘內(nèi)型”差別。不同的內(nèi)型可能解釋不同哮喘“表型”的病理生理過程。目前發(fā)現(xiàn)內(nèi)型為“Th2增高(Th2-high)”的患者，表現(xiàn)為過度增強(qiáng)的Th2型免疫應(yīng)答，Th2細(xì)胞過度活化及其相關(guān)

2、細(xì)胞因子IL-4、IL-5等的產(chǎn)生增多，同時氣道以嗜酸性粒細(xì)胞浸潤為主。臨床上的過敏性哮喘為“Th2增高”的內(nèi)型，通常由吸入的過敏原所誘發(fā)，具有明顯的Th2型免疫反應(yīng)，同時伴有氣道內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞聚集，氣道平滑肌的增生，以及血清IgE的升高。
　　IL-17A是一種主要由Th17細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，Th17細(xì)胞具有明顯區(qū)別于Th1、Th2細(xì)胞的特征，其分化受到IFN-γ和IL-4的負(fù)性調(diào)控。IL-17A的主要生物

3、學(xué)作用是在機(jī)體內(nèi)通過引起中性粒細(xì)胞的聚集、活化，參與抵抗病原體的感染以及風(fēng)濕類疾病等。IL-17A是參與中性粒細(xì)胞炎癥非常重要的細(xì)胞因子。近年來研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者的血和肺中IL-17A因子的濃度增高，并且和哮喘的嚴(yán)重程度相關(guān)，提示IL-17A可能參與了哮喘慢性氣道炎癥的發(fā)生和發(fā)展，特別是與中性粒細(xì)胞性哮喘有關(guān)。
　　國內(nèi)外多個研究中發(fā)現(xiàn)IL-17A具有促炎效應(yīng)以及一定的抑炎效應(yīng)，即IL-17A可能存在雙重效應(yīng)，研究中抑制炎癥的效應(yīng)可

4、能是低濃度IL-17A所引起的。我們既往的研究發(fā)現(xiàn)，利用IL-17A基因敲除小鼠建立OVA誘導(dǎo)的哮喘模型同時給予LPS氣道干預(yù)時較野生鼠的氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥增高及脾臟Th2細(xì)胞分化增多。因此，我們假設(shè)IL-17A能通過直接抑制Th2細(xì)胞分化，減輕哮喘小鼠的氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥。本研究通過OVA致敏和激發(fā)建立氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤為主的哮喘小鼠模型，并觀察IL-17A對哮喘小鼠氣道嗜酸性粒細(xì)胞炎癥以及Th2型免疫的影響及其機(jī)制。
　

5、　研究目的:
　　1.探索IL-17A在哮喘小鼠氣道炎癥中的作用，包括肺部炎癥細(xì)胞浸潤程度以及BALF中細(xì)胞分類和細(xì)胞因子的變化。
　　2.探索IL-17A在哮喘小鼠支氣管淋巴結(jié)和脾臟以及體外培養(yǎng)中的Th2細(xì)胞分化中的作用。
　　研究方法:
　　第一章 IL-17A對哮喘小鼠氣道炎癥的影響
　　1.OVA誘導(dǎo)的哮喘小鼠模型的建立及氣道干預(yù)處理
　　實(shí)驗(yàn)分為三組，即對照組、模型組、IL-17A處理組。在

6、建模第1、7天，模型組和IL-17A處理組小鼠腹腔注射OVA致敏，第14-18天用1％ OVA霧化1h激發(fā)，對照組均予以等量生理鹽水;IL-17A處理組小鼠每次激發(fā)前1h麻醉后氣道滴入100 ng IL-17A，對照組及模型組予以等量生理鹽水。
　　2.BALF、肺組織標(biāo)本的檢測
　　收集BALF液計(jì)細(xì)胞總數(shù)，離心后上清用ELISA法檢測IL-4、IL-5、INF-γ、 IL-17A濃度，所得沉淀涂片后染色行分類計(jì)數(shù);左肺切

7、片后行HE及PAS染色，于顯微鏡下觀察進(jìn)行半定量評分。
　　第二章 IL-17A對哮喘Th2細(xì)胞分化的抑制作用及機(jī)制
　　1.小鼠支氣管淋巴結(jié)及脾臟Th細(xì)胞分化的檢測
　　制備淋巴結(jié)和脾臟單細(xì)胞懸液，刺激培養(yǎng)后利用流式細(xì)胞術(shù)檢測Th1/2/17的分化比例。
　　2.IL-17A在體外誘導(dǎo)幼稚CD4+T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化中的抑制作用
　　制備脾臟單細(xì)胞懸液，用免疫磁珠分選幼稚CD4+T細(xì)胞，用分化因子液加或

8、者不加30 ngIL-17A同完全培養(yǎng)基一起培養(yǎng)細(xì)胞。在48h洗滌細(xì)胞后，用僅含IL-2的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至96h。利用流式細(xì)胞術(shù)檢測培養(yǎng)24h、96h時Th細(xì)胞分化。利用AnnexinV/PI法檢測孵育24h時細(xì)胞凋亡程度。相同的培養(yǎng)條件下利用CCK8法比較培養(yǎng)24h時的增殖活力。
　　研究結(jié)果:
　　第一章 IL-17A對哮喘小鼠氣道炎癥的影響
　　1.BALF中細(xì)胞總數(shù)及各類細(xì)胞計(jì)數(shù)及其比例的比較
　　模

9、型組較對照組小鼠BALF中的細(xì)胞總數(shù)高，具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.01)，IL-17A處理組小鼠的BALF細(xì)胞總數(shù)明顯低于模型組小鼠(P＜0.05);模型組BALF嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)(P＜0.05)和比例(P＜0.01)明顯高于對照組，而IL-17A處理組嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)(P＜0.05)及其比例(P＜0.01)明顯低于模型組，但I(xiàn)L-17A處理組嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)及其比例仍高于對照組(P＜0.01);模型組及IL-17A處理組中性粒細(xì)胞數(shù)及淋

10、巴細(xì)胞數(shù)較對照組有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.小鼠肺部支氣管和血管周圍炎癥浸的比較
　　對照組小鼠肺部未見有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤;模型組較對照組小鼠的支氣管周圍和血管周圍有更明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，半定量評分更高(P＜0.01);予以IL-17A氣道滴入后，IL-17A處理組小鼠支氣管周圍和血管周圍炎癥浸潤程度明顯低于模型組小鼠，且炎癥評分有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);相比對照組，IL-17A處理

11、組小鼠肺部的炎癥浸潤仍較顯著(P＜0.01)。
　　3.小鼠氣道杯狀細(xì)胞化生程度及半定量評分比較
　　對照組小鼠的氣道中未見明顯的杯狀細(xì)胞化生;模型組小鼠氣道中較對照組可見更多的PAS陽性細(xì)胞，半定量評分具有顯著差異(P＜0.01);IL-17A處理組較模型組小鼠的氣道中杯狀細(xì)胞化生程度低(P＜0.01)。
　　4.小鼠BALF中Th相關(guān)細(xì)胞因子的比較
　　模型組小鼠BALF上清中的Th1相關(guān)因子IFN-γ濃度顯

12、著低于對照組(P＜0.01)，Th2相關(guān)因子IL-4、IL-5濃度顯著高于對照組(P＜0.01)，IL-17A濃度也顯著高于對照組(P＜0.01);IL-17A處理組小鼠BALF中IL-4、IL-5濃度顯著低于模型組(P＜0.01)，IL-17A濃度顯著高于模型組(P＜0.01)，兩組之間IFN-γ濃度無顯著差異(P＞0.05);IL-17A處理組小鼠IL-4(P＜0.01)、IL-5(P＜0.05)濃度仍顯著高于對照組，IFN-γ濃度

13、顯著低于對照組(P＜0.01)，IL-17A濃度也顯著高于對照組(P＜0.01)。
　　第二章 IL-17A對哮喘Th2細(xì)胞分化的抑制作用及機(jī)制
　　1.小鼠支氣管淋巴結(jié)中Th細(xì)胞分化的比較
　　模型組小鼠淋巴結(jié)中Th1比例低于對照組(P＜0.01)，Th2比例高于對照組(P＜0.05)，兩組之間Th17比例無顯著性差異(P＞0.05);IL-17A處理組較模型組小鼠有更低的淋巴結(jié)Th2比例(P＜0.05)，兩組Th1

14、和Th17比例之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);IL-17A處理組Th2比例顯著高于對照組小鼠(P＜0.05)，Th1比例顯著低于對照組小鼠(P＜0.01)，兩組小鼠Th17比例之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.小鼠脾臟Th細(xì)胞分化程度比較
　　模型組小鼠脾臟Th1比例低于對照組(P＜0.01)，Th2比例顯著高于對照組(P＜0.01)，兩組Th17比例之間無顯著差異(P＞0.05);給予IL-17A氣道滴

15、入后，IL-17A處理組小鼠脾臟Th2比例顯著低于模型組(P＜0.01)，兩組之間Th1和Th17均無顯著差異(P＞0.05);IL-17A處理組小鼠脾臟Th1細(xì)胞比例仍低于對照組(P＜0.01)，兩組之間Th17比例差異不顯著(P＞0.05)。
　　3.IL-17A在體外誘導(dǎo)幼稚CD4+T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化中的抑制作用
　　在24h時，Th2極化組和Th2+IL-17A極化組之間細(xì)胞凋亡和增殖均無顯著差異(P＞0.05)

16、。Th2+IL-17A極化組中Th2細(xì)胞分化比例在培養(yǎng)24h時較Th2極化組呈下降趨勢(P＞0.05)，在培養(yǎng)至96h，IL-17A明顯抑制Th2細(xì)胞分化(P＜0.01)。
　　研究結(jié)論:
　　1.給OVA復(fù)制的哮喘模型氣道滴入IL-17A后可減輕肺部嗜酸性粒細(xì)胞浸潤和降低BALF中Th2相關(guān)因子IL-4、IL-5的濃度。而且，不導(dǎo)致氣道中性粒細(xì)胞炎癥。
　　2.哮喘小鼠中支氣管淋巴結(jié)和脾臟的Th2細(xì)胞比例明顯高于對照

17、組，IL-17A氣道滴入后可以降低Th2細(xì)胞分化比例，而不影響Th1細(xì)胞比例。IL-17A在體外還可抑制幼稚CD4+T細(xì)胞向Th2細(xì)胞分化，而對其增殖和凋亡無顯著影響。
　　研究意義:
　　哮喘的“衛(wèi)生學(xué)說”認(rèn)為，兒童時期接觸細(xì)菌內(nèi)毒素等可以通過刺激Th1細(xì)胞分化，來抑制Th2的分化，改善Th2/Th1失衡，從而減少哮喘的發(fā)病。本文的研究證實(shí)了，通過氣道內(nèi)給予IL-17A處理，也可以抑制Th2的分化，改善哮喘氣道的嗜酸細(xì)胞性