結核分枝桿菌人新B細胞表位及10種特異蛋白的抗原性研究.pdf

1、在結核?。═B）的免疫學研究中，特異抗原及其抗原表位的研究對結核病的診斷技術和疫苗發(fā)展具有極為重要的作用。抗原表位是決定抗原特異性和免疫效能的特殊基團或空間結構。B細胞表位在感染免疫中發(fā)揮了重要作用，如激活體液免疫應答和調(diào)節(jié)細胞免疫應答。因此，研究抗原 B細胞表位，有助于結核病快速診斷試劑和疫苗的研究。本研究一是開展結核分枝桿菌(MTB)新抗原的B細胞表位預測和篩選，二是選取抗原表位數(shù)較多的特異性抗原進行克隆表達純化，并對純化的重組蛋白

2、及 B表位多肽進行血清學評價，為研發(fā)結核病特異診斷試劑和新疫苗提供基礎。
　　根據(jù)基因組學、蛋白質(zhì)組學、免疫組學和生物信息學原理，排除PE/PPE蛋白、轉座子基因以及已知B表位的蛋白抗原，從結核分枝桿菌全基因組的蛋白質(zhì)基因序列中篩選新的蛋白抗原。利用生物信息學和SEPPA2.0軟件，預測新抗原的B細胞表位，分析、優(yōu)選并合成B細胞表位多肽。
　　閱讀文獻、根據(jù)美國國立生物技術信息中心(NCBI)和免疫表位數(shù)據(jù)庫（IEDB），分

3、析并選擇有抗原表位的結核分枝桿菌特異性抗原。蛋白抗原的編碼基因以標準株H37Rv的DNA為模板，PCR擴增并提取目的基因，以原核表達載體PET32a構建重組質(zhì)粒，雙酶切鑒定和測序100％正確的重組子進行誘導表達，SDS-PAGE分析鑒定。大量誘導后鎳離子親和層析柱層析純化，純化效果不理想的蛋白再次使用純化試劑盒進行純化。純化后的包涵體進行復性，使用BCA法對蛋白的濃度進行測定。
　　將合成的B細胞表位多肽及純化后的蛋白包被酶標板，

4、棋盤滴定法確定抗原及多肽、一抗和二抗的最佳稀釋度，以結核病人血清及健康志愿者的血清為一抗，間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）對B細胞表位多肽及重組蛋白抗原進行評價。
　　本研究經(jīng)過軟件的預測及篩選，成功預測并合成了結核分枝桿菌3個新蛋白的共13條B細胞線性表位多肽，包括蛋白SodC成功合成3條， Mog為4條和Rv1566c為6條，每條多肽的純度大于90%，滿足實驗要求。Mog抗原成功預測了構象表位，構象表位需要通過重組蛋白的克隆

5、表達，再進行血清學驗證。
　　本研究通過文獻檢索及生物信息學篩選，確定了9個已知特異性蛋白抗原，并完成了此九種蛋白及構象表位抗原Mog的克隆表達純化，酶切鑒定結果正確，測序結果與NCBI中的序列完全一致。10種蛋白的誘導表達純化，最終得到了純化效果較理想的重組蛋白。
　　間接ELISA法對B表位多肽及10種蛋白抗原進行評價，棋盤滴定確定多肽的包被濃度為3.13μg/ml，蛋白抗原PfkB、Rv2628、Rv2653c、Mpt

6、83、Mpt70、Lppx、EsxR、FadD28、DevS和Mog的最佳包被濃度分別為0.46μg/ml、1.03μg/ml、1.31μg/ml、1.53μg/ml、1.20μg/ml、1.15μg/ml、5.53μg/ml、0.85μg/ml、1.08μg/ml和1.65μg/ml。血清的最佳稀釋度PfkB為1:50，EsxR為1:400，Rv2628、Rv2653c、Mpt83、Mpt70、Lppx、FadD28、DevS、Mog

7、及多肽的血清最佳稀釋度均為1:100。
　　該實驗選取了104份陽性血清和104份陰性血清，ELISA法分別對10種蛋白抗原及13條多肽進行血清學評價。使用SPSS17.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)，PfkB、Rv2628、Rv2653c、Mpt83、Mpt70、Lppx、EsxR、FadD28、DevS和Mog的靈敏度分別為73.08%、54.81%、58.65%、94.23%、79.81%、77.88%、92.31%、86.54%、91

8、.35%、89.42%，特異度分別為90.57%、94.34%、87.74%、59.43%、86.79%、77.36%、62.26%、82.08%、83.96%、69.81%，ROC曲線下面積分別為0.882、0.789、0.773、0.825、0.884、0.851、0.822、0.891、0.870和0.901。除Rv2628、Rv2653c的Youden指數(shù)小于0.5外，其它蛋白的Youden指數(shù)均大于0.5，Mog的Youden

9、指數(shù)最大為0.734。SodC的3條B細胞表位多肽，靈敏度分別為88.46%、65.38%、72.12%，特異度為75.96%、91.35%和89.42%，ROC曲線下面積均大于0.85。Mog蛋白的4條B細胞表位多肽中P209的靈敏度、特異度最高，分別為88.46%、88.69%，ROC曲線下面積為0.934。Rv1566c的6條B細胞表位多肽，靈敏度范圍為77.88%~92.31%，特異度介于69.23%~85.58%，ROC曲線下