海分枝桿菌(Mycobacter I um marinum)的分離鑒定及其抗原性研究.pdf

1、本文主要工作如下：
　　 1.本研究從帶菌狀態(tài)的黑解粘液、背鰭等部位分離到菌株FZ09，其生理生化特性與海分枝桿菌Rl相同，并且將兩株菌同時進(jìn)行人工感染黑鰓的實(shí)驗(yàn)，黑裙發(fā)病率為0。海分枝桿菌屬于條件致病菌，不容易引發(fā)正常組織病變，而保留在正常組織中，部分水產(chǎn)動物尤其是一些硬棘類動物，其感染海分枝桿菌后可以不發(fā)病，處于帶菌狀態(tài)。這種攜帶海分枝桿菌感染而不發(fā)病死亡的硬棘水產(chǎn)動物往往是感染軟棘魚類甚至是人類的罪魁禍?zhǔn)住?br>　　

2、2.本研究利用HPLC技術(shù)與生理生化及PCR技術(shù)共同鑒定出分離的菌株FZ09為海分枝桿菌，表明研究結(jié)果的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分枝菌酸指紋圖譜鑒定技術(shù)的穩(wěn)定性、重復(fù)性很高，為分枝桿菌的鑒定提供了更為可靠準(zhǔn)確的方法。
　　 3.用不同碳源成分的培養(yǎng)基培養(yǎng)海分枝桿菌FZ09四周，菌落生長結(jié)果顯示:與Na2C03,Tween80,Tween20相比，甘油是最好的碳源成分，可以促進(jìn)海分枝桿菌生長旺盛。Tween80對菌株的快速鑒定有一定優(yōu)勢。

3、海分枝桿菌對于有機(jī)碳源的選擇與結(jié)核分枝桿菌存在區(qū)別。
　　 4.用海分枝桿菌FZ09的全菌細(xì)胞免疫鼠制備抗血清，ELISA方法測得血清抗體效價為6400，說明菌株FZ09具有很強(qiáng)的抗原性，能夠有效地刺激鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答。經(jīng)IFA'I，檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Z09的抗血清能夠與分枝桿菌屬的其它細(xì)菌發(fā)生交叉反應(yīng)，與非分枝桿菌屬細(xì)菌則沒有交叉，表明該血清是檢測分枝桿菌免疫學(xué)特征的有效工具。
　　 5.28℃及34℃培養(yǎng)的細(xì)菌蛋白條帶分布相

4、同，主要有:97kDa,84kDa,56kDa,50kDa,45kDa,35kDa,28kDa,23kDa,19kDa,11kDaoWestern-blot分析顯示其中僅有1條45kDa蛋白條帶具有良好的抗原性。蛋白等電點(diǎn)在雙向電泳圖譜上的偏酸性端，分布范圍在pH4.5-5.5。而37℃培養(yǎng)時的蛋白條帶明顯減少，缺少的主要條帶有:23kDa、19kDa,11kDa，并且沒有抗原免疫蛋白帶，蛋白等電點(diǎn)分布區(qū)域減少。45kDa蛋白可能與海分

5、枝桿菌的致病性有關(guān)，而37℃條件下，海分枝桿菌可能改變了細(xì)胞結(jié)構(gòu)，失去原有的抗原性及致病特點(diǎn)。
　　 6.3種不同方法提取的脂多糖經(jīng)電泳銀染后，有多條相同條帶，主要是在14kDa,16kDa及23kDa分子量處形成了幾條較為清晰的條帶，Western-blot及間接ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示提取物與抗血清結(jié)合部位主要為核心多糖成分。類脂A部分由于分子量較大，所帶電荷的原因不容易跑開，聚集在凝膠上部，核心多糖由于分子量較小則快速遷移至

6、膠的底部，多糖側(cè)鏈根據(jù)分子量的大小依次分布，但多糖鏈不明顯。這3條蛋白帶可以為海分枝桿菌亞單位疫苗的開拓提供參考。
　　 7.進(jìn)行血清學(xué)檢測時發(fā)現(xiàn)海分枝桿菌對腹腔注射組的昆明鼠具有感染能力，其肝臟出現(xiàn)肉芽腫;以細(xì)菌脂多糖作為反應(yīng)底物的敏感度要明顯高于細(xì)菌全菌，而且各感染組都表現(xiàn)為明顯的陽性結(jié)果;其次，昆明鼠各感染組的值要顯著高于大鼠各組，表明該菌株對小鼠的感染比大鼠強(qiáng)三種方法提取的脂多糖檢測病原血清的敏感性不同，脂多糖1的敏感性