海分枝桿菌細(xì)胞壁毒力成分分離鑒定及功能研究.pdf

1、據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，全世界約有三分之一的人口感染了結(jié)核分枝桿菌。2009年，全球新發(fā)結(jié)核病例940萬例，死亡170萬例，結(jié)核病仍然是全球公共衛(wèi)生安全的重大威脅[1]。雖然結(jié)核病的發(fā)病率只有5％到10％，但由于龐大的感染人群，結(jié)核病現(xiàn)在仍然是僅次于艾滋病的全球第二大感染性疾病。從目前的流行趨勢(shì)來看，至2020年，結(jié)核病仍然會(huì)居于全球最嚴(yán)重的十大疾病之列。亞洲主要發(fā)展中國(guó)家，例如印度、中國(guó)、巴基斯坦和印度尼西亞集中了全球50％以上

2、的結(jié)核病例，結(jié)核病防控形勢(shì)嚴(yán)峻。因此，對(duì)結(jié)核病致病機(jī)制的闡明進(jìn)而為抗結(jié)核新藥和新疫苗開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)就顯得尤為重要。
　　海分枝桿菌是近年來發(fā)展起來的研究結(jié)核分枝桿菌致病性的模式生物[2-10]。為了分離和鑒定海分枝桿菌新的毒力因子，我們通過對(duì)海分枝桿菌轉(zhuǎn)座子突變庫(kù)的篩選，我們得到了一些菌落形態(tài)發(fā)生改變的菌株，對(duì)菌株的插入位點(diǎn)進(jìn)行鑒定后發(fā)現(xiàn)，有三株突變株的轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)均位于同一基因內(nèi)。這一基因?yàn)楹７种U菌的ppe38(MMAR_

3、3661)基因，與結(jié)核分枝桿菌ppe38(Rv2352c)基因的DNA序列相似性為82％，與PPE38蛋白的氨基酸序列相似性為73％。
　　PE(proline-glutamicacid)和PPE（proline-proline-glutamicacid）家族蛋白是分枝桿菌特有的蛋白，在致病性分枝桿菌中廣泛存在。前人的研究表明，這類蛋白可能定位于細(xì)胞壁或分泌到胞外，但它們?cè)诮Y(jié)核分枝桿菌致病性中發(fā)揮的功能還有待研究[11-19]。本

4、研究對(duì)海分枝桿菌ppe38突變菌株的細(xì)菌生物學(xué)表型研究發(fā)現(xiàn)，突變株不僅菌落形態(tài)發(fā)生顯著改變，細(xì)菌沉積速率提高，遷移速率顯著降低，不能形成生物膜。所有的生物學(xué)表型在互補(bǔ)表達(dá)海分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌的PPE38蛋白后，都完全回復(fù)。Westernblot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PPE38蛋白定位于分枝桿菌細(xì)胞壁。更有意思的是，PPE38突變后，海分枝桿菌典型的索狀結(jié)構(gòu)特征消失。由于結(jié)核分枝桿菌致病菌H37Rv具有典型的索狀結(jié)構(gòu)，而非致病菌H37Ra不具有索

5、狀結(jié)構(gòu)，所以幾十年來，索狀結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是致病性分枝桿菌的典型結(jié)構(gòu)[20]。而以往發(fā)現(xiàn)的與索狀結(jié)構(gòu)形成相關(guān)的因子，均參與細(xì)胞壁脂質(zhì)成分的合成。PPE38是一個(gè)新發(fā)現(xiàn)的索狀因子，證實(shí)了細(xì)胞壁蛋白在細(xì)菌索狀結(jié)構(gòu)中起到的關(guān)鍵作用。
　　PPE38暴露于細(xì)胞壁表面提示其極易與宿主細(xì)胞相互作用。為了研究PPE38是否在分枝桿菌致病中發(fā)揮作用，我們利用斑馬魚感染模型，研究PPE38突變株的毒力改變。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，感染突變株的斑馬魚生存時(shí)間較野生組

6、顯著延長(zhǎng)。肝臟CFU計(jì)數(shù)表明突變株在斑馬魚體內(nèi)的增殖速度低于野生株。組織病理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在感染15天后，野生型感染組中出現(xiàn)大范圍組織壞死，完整的肉芽腫結(jié)構(gòu)少見，大量海分枝桿菌播散至壞死組織區(qū)域，除肝臟外，腸絨毛和腹膜間隙也觀察到很多細(xì)菌。而突變株感染組在15天時(shí)，細(xì)菌多局限于完整的肉芽腫結(jié)構(gòu)中，周圍組織壞死少見。提示PPE38在體內(nèi)能夠?qū)е陆M織壞死，從而加速細(xì)菌播散，加速斑馬魚死亡。
　　使用突變株感染巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，突變株對(duì)巨噬細(xì)

7、胞的侵染能力顯著降低。同時(shí)，突變株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖速度減慢，對(duì)巨噬細(xì)胞的毒性減低。更進(jìn)一步的，通過使用突變株或過表達(dá)PPE38蛋白的恥垢分枝桿菌侵染巨噬細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)，PPE38蛋白能夠誘導(dǎo)促炎因子TNF-α和IL-6的表達(dá)。本研究表明PPE38蛋白能夠調(diào)節(jié)宿主免疫應(yīng)答，是分枝桿菌重要的致病因子。（第一章）
　　通過對(duì)海分枝桿菌轉(zhuǎn)座子突變庫(kù)的篩選，我們發(fā)現(xiàn)一個(gè)突變株的菌落表型顯著改變。該突變株的突變位點(diǎn)位于MMAR_2340(p

8、ks5)和MMAR_2341之間。Real-timePCR結(jié)果表明，突變?cè)斐蓀ks5基因表達(dá)下調(diào)20倍，而MMAR_2341表達(dá)無變化。由于pks5在脂質(zhì)合成中起作用，突變株的細(xì)胞壁脂質(zhì)合成可能發(fā)生改變。2D-TLC實(shí)驗(yàn)證明，pks5突變株細(xì)胞壁脂質(zhì)成分LOSs合成完全消失，而將pks5基因互補(bǔ)回突變株，其LOSs合成完全回復(fù)。LOSs是分枝桿菌重要的脂質(zhì)成分，對(duì)LOSs功能的研究還不深入，有研究表明，純化的LOSs能夠抑制巨噬細(xì)胞TN

9、F-α的分泌，提示LOSs可能類似于PGL，是分枝桿菌的毒力脂質(zhì)[21]。
　　對(duì)pks5突變株研究發(fā)現(xiàn)，在LOSs缺失后，海分枝桿菌索狀結(jié)構(gòu)改變，沉積速率提高，遷移能力減弱。同時(shí)，突變株對(duì)巨噬細(xì)胞的侵染能力下降，但突變株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)速率與野生型相比沒有顯著性差異。
　　為了研究LOSs是否在分枝桿菌致病性中發(fā)揮作用，我們使用斑馬魚感染模型，觀察LOSs突變株是否在斑馬魚體內(nèi)減毒。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，pks5突變株感染的斑馬魚較

10、野生型菌株感染的斑馬魚生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)。肝臟菌載量實(shí)驗(yàn)表明，pks5突變株在斑馬魚體內(nèi)增殖減慢。為了進(jìn)一步證實(shí)LOSs是毒力因子，我們利用另一株LOSs的突變株1271（只合成LOSI），進(jìn)行斑馬魚感染實(shí)驗(yàn)，同樣發(fā)現(xiàn)1271在斑馬魚體內(nèi)減毒，從而證明LOSs是海分枝桿菌重要的毒力脂質(zhì)。（第二章）
　　分子流行病學(xué)是研究結(jié)核分枝桿菌傳播和種群進(jìn)化的有力工具。研究表明，不同進(jìn)化分支上的結(jié)核分枝桿菌在不同的國(guó)家和地區(qū)流行，不同基因型菌株

11、的致病性和傳播力不盡相同。例如，一些細(xì)胞和動(dòng)物模型證明在東亞流行的北京基因型菌株相比起其他基因型的菌株具有更高的毒力，能夠抑制宿主的免疫反應(yīng)。
　　本研究根據(jù)3R基因(DNARepair,DNARecombination，DNAReplication;DNA修復(fù)，DNA重組，DNA復(fù)制相關(guān)基因)的單核苷酸多態(tài)性(SingleNucleotidePolymorphisms，SNP)，構(gòu)建了上海地區(qū)北京基因型菌株的進(jìn)化樹[22]。將北

12、京基因型菌株分為7個(gè)亞型(Bmyc2，Bmyc4，Bmyc6，Bmyc10，Bmyc13，Bmyc25和Bmyc26)。各亞型菌株的群體數(shù)量差異很大，其中一個(gè)新進(jìn)化出的亞型(Bmyc10)在人群中占有主導(dǎo)地位，大于50％的北京基因型菌株屬于該亞群，提示該亞型的菌株在致病性和傳播力上可能比其它亞型具有一定優(yōu)勢(shì)。
　　為了研究北京基因型不同亞型菌株引起宿主免疫應(yīng)答的差異，我們使用不同亞型的代表性菌株和非北京型菌株H37Rv，感染巨噬細(xì)

13、胞，在不同的時(shí)間點(diǎn)收集細(xì)胞RNA，用Microarray研究巨噬細(xì)胞基因表達(dá)水平的差異。結(jié)果表明，通過對(duì)轉(zhuǎn)錄譜結(jié)果聚類分析發(fā)現(xiàn)，在感染后18小時(shí)，H37Rv能夠與北京基因型菌株分開，但北京基因型各亞型與成簇?zé)o相關(guān)性。對(duì)感染后的細(xì)胞上清中細(xì)胞因子進(jìn)行檢測(cè)，也未發(fā)現(xiàn)各個(gè)菌株亞型之間的差異，提示北京基因型各亞型菌株引發(fā)的THP-1細(xì)胞免疫應(yīng)答沒有顯著性差異。對(duì)13株分枝桿菌感染巨噬細(xì)胞后差異表達(dá)的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析可以發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)的大多數(shù)