活性GlmU在分枝桿菌中生長(zhǎng)必需性及其缺失后對(duì)細(xì)胞壁完整性影響的研究.pdf

1、本課題利用與結(jié)核分枝桿菌有相同細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，但生長(zhǎng)快速且無(wú)致病性的恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis，Sm)mc<'2>155菌株作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，以glmU基因作為研究對(duì)象，并采用基于同源重組的插入突變方法使．glmU基因發(fā)生突變。目的是用基因敲除的方法證明結(jié)核分枝桿菌中g(shù)lmU基因是分枝桿菌生長(zhǎng)過(guò)程中所必需的基因，并對(duì)glmU基因敲除菌株進(jìn)行了一系列的表型變化觀察及細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)的聚糖組成成分分析，從而證明glmU基

2、因在分枝桿菌生長(zhǎng)過(guò)程中具有重要作用，這將為其作為研發(fā)抗結(jié)核新藥的靶標(biāo)提供有力的證據(jù)。 本論文獲得以下結(jié)果： 1.SmglmU基因的擴(kuò)增和克隆從TIGR基因數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.tigr.org/tdb/)獲得M smegmatis me<'2>155菌株的glmU基因的核苷酸序列。根據(jù)Sm glmU基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，用高保真LA Taq DNA聚合酶從mc<'2>155基因組中擴(kuò)增Sm glmU基因及其上

3、游約500 bp的DNA序列，并將其克隆到pMD18-T的克隆質(zhì)粒上，用BcaBEST測(cè)序引物和M13引物對(duì)Sm glmU基因的兩端進(jìn)行DNA序列測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果與已知的SmglmU 基因進(jìn)行相似性比較，得到與mc<'2>155基因組上Sm glmU基因序列完全一致的克隆質(zhì)粒。 2.條件性復(fù)制質(zhì)粒pPR27-xylE-Sm glmU::Kan<'R>的構(gòu)建將來(lái)自于質(zhì)粒pUC4K的Kan<'R>月克隆到Sm glmU基因內(nèi)部，產(chǎn)生

4、SmglmU::Kan<'R>突變基因。將Sm glmU::Kan<'R>月突變基因克隆到pPR27-xylE質(zhì)粒，構(gòu)建出條件性復(fù)制質(zhì)粒pPR27-xylE-Sm glmU::Kan<'R>。pPR27攜帶溫度敏感型復(fù)制子，該質(zhì)粒在30°C條件下可以復(fù)制，在42°C條件下不能復(fù)制。pPR27攜帶的sacB基因?yàn)樨?fù)選擇標(biāo)記，該基因表達(dá)產(chǎn)物蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶(Levansucrase)能夠分解蔗糖，產(chǎn)生對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)有害的聚果糖，使細(xì)菌死亡。

5、xy/E基因產(chǎn)物是兒茶酚2，3-氧化還原酶，它能氧化兒茶酚成黃色的化合物，使菌落呈現(xiàn)金黃色。 3.營(yíng)救質(zhì)粒的構(gòu)建營(yíng)救質(zhì)粒攜帶正常的M tuberculosis glmU基因，其作用是在mc<'2>155 glmU基因敲除菌株中補(bǔ)償突變的glmU基因的功能。本實(shí)驗(yàn)用高保真LA Taq DNA聚合酶分別從M tuberculosis H37Rv菌株基因組中擴(kuò)增Tb glmU基因，構(gòu)建營(yíng)救質(zhì)粒pCG76-Phsp60-Tb glmU。

6、pCG76為分枝桿菌表達(dá)質(zhì)粒，pCG76攜帶溫度敏感型復(fù)制子，即該質(zhì)粒在30°c條件下可以復(fù)制，在42°c條件下不能復(fù)制。TbglmU基因的表達(dá)受來(lái)源于分枝桿菌BCG熱休克蛋白60的啟動(dòng)子Phsp60控制。pCG76-phsp60-Tb glmU營(yíng)救質(zhì)粒用于證明TbglmU是否為分枝桿菌生長(zhǎng)相關(guān)基因。 4.第一次同源重組突變菌株mc<'2>155 glmU SCO-1的篩選將條件復(fù)制性質(zhì)粒pPR27-xylE-Sm glmU::

7、Kan<'R>電轉(zhuǎn)化到mc<'2>155感受態(tài)細(xì)胞中。依據(jù)pPR27-xylE-Sm glmU::Kan<'R>質(zhì)粒在30°C時(shí)能復(fù)制，在42°C時(shí)不能復(fù)制，在42°C條件下培養(yǎng)攜帶pPR27-xylE-Sm glmU::Kan<'R>質(zhì)粒的mc<'2>155，迫使pPR27-xylE-Sm glmU::Kan<'R>質(zhì)粒的Sm glmU::Kan<'R>與mc<'2>155基因組中的SmglmU發(fā)生同源重組，使Sm glmU::Kan

8、<'R>以及sacB基因、xylE基因整合到mc<'2>155基因組中。用地高辛標(biāo)記的Sm glmU探針(DIG-Sm glmU)對(duì)經(jīng)過(guò)Sinai酶切的第一次重組菌落的基因組DNA進(jìn)行Southern雜交分析，當(dāng)結(jié)果中出現(xiàn)預(yù)期的雜交條帶為發(fā)生第一次同源重組的突變菌株mc<'2>155 glmU SCO-1(the firstsingle crossover)。 5．第二次同源重組突變菌株mc<'2>155 glmU SCO-2(glmU

9、基因敲除)的篩選將攜帶 Tb glmU 基因的營(yíng)救質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到mc<'2>155 glmU SCO-1 感受態(tài)細(xì)胞中，在30℃條件下，在含10﹪蔗糖的選擇性L(fǎng)B瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的mc<'2>155glmU SCO-1，由于pPR27-xylE-Sm glmU∶∶Kan<'R>的 sacB基因和 xylE 基因也被整合到mc<'2>155 glmU SCO-1 基因組中，sacB基因的表達(dá)產(chǎn)物蔗糖6-果糖基轉(zhuǎn)移酶能水解蔗糖，產(chǎn)生引起mc<

10、'2>155 glmU SCO-1 致死的聚果糖，在這種選擇壓力下，mc<'2>155 glmU SCO-1 基因組中的Sm glmU∶∶Kan<'R>與Sm glmU發(fā)生第二次同源重組，將Sm glmU基因、scaB基因以及．xylE基因從mc<'2>155 glmU SCO-1 基因組中刪除并被核酸酶水解，基因組中只存在Sm glmU∶∶Kan<'R>。營(yíng)救質(zhì)?？梢栽趍c<'2>155glmU KOT 突變菌株中表達(dá)出 Tb Glm

11、U蛋白質(zhì)，從而補(bǔ)償基因組上失活的SmGlmU的生物學(xué)作用。同樣地，應(yīng)用Southem印跡方法篩選出mc<'2>155 glmUSCO-2(the second single crossover)，即 Sm glmU 基因敲除菌株 mc<'2>155 glmU KOT(glmUknock out，基因敲除)6．生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定在30℃及42℃條件下，每間隔24小時(shí)測(cè)定mc<'2>155 glmU KOT 突變菌株在600 nm處的光吸收值，

12、并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。生長(zhǎng)曲線(xiàn)的結(jié)果表明，對(duì)照的野生型菌株即能在30℃條件下又能在42℃條件下生長(zhǎng)；而突變菌株在30℃條件下能夠生長(zhǎng)，而在42℃條件下卻失去生長(zhǎng)能力。因而說(shuō)明了結(jié)核分枝桿菌的glmU基因?yàn)榉种U菌生長(zhǎng)相關(guān)基因。 7．溫度轉(zhuǎn)換后生長(zhǎng)曲線(xiàn)和菌落形成單位(CFU)曲線(xiàn)的繪制mc<'2>155 glmU KOT菌株和野生型的mc<'2>155菌株在30℃條件下生長(zhǎng)至OD<,600>為0.09，然后轉(zhuǎn)變溫度為42℃后繼續(xù)生長(zhǎng)，每

13、隔24小時(shí)測(cè)定其在600 nm的吸光度值，并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。溫度轉(zhuǎn)換后的生長(zhǎng)曲線(xiàn)結(jié)果顯示，野生型的mc<'2>155菌株，溫度的轉(zhuǎn)換對(duì)其生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的影響；而mc<'2>155 glmU KOT、菌株，在轉(zhuǎn)變溫度后的24小時(shí)之內(nèi)，細(xì)菌會(huì)繼續(xù)生長(zhǎng)，并達(dá)到吸光度值的最高值；然而繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間，細(xì)菌不再生長(zhǎng)，其吸光度值持續(xù)下降。對(duì)mc<'2>155 glmU KOT 菌株同時(shí)進(jìn)行對(duì)可活菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)的菌落形成單位(colony forming un

14、it，CFU)測(cè)定，結(jié)果表明mc<'2>155 glmU KOT 菌株的吸光度值與CFU具有相同的趨勢(shì)，即都在轉(zhuǎn)變溫度后的24小時(shí)左右達(dá)到最高值，接下來(lái)持續(xù)下降。此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)glmU基因?yàn)榉种嵘L(zhǎng)所必需的基因，且mc<'2>155 glmU KOT 菌株在溫度轉(zhuǎn)變后光吸收值的降低是由于細(xì)菌的死亡。 8．應(yīng)用顯微鏡技術(shù)對(duì)細(xì)胞形態(tài)的觀察mc<'2>155 glmU KOT菌株的生長(zhǎng)條件與CFU測(cè)定實(shí)驗(yàn)中細(xì)菌的生長(zhǎng)條件相同，收

15、獲細(xì)菌后，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡和掃描電子顯微鏡觀察其形態(tài)。光鏡的結(jié)果顯示，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)在30°C時(shí)細(xì)胞呈野生型細(xì)菌般的長(zhǎng)棒狀；但當(dāng)細(xì)胞的生長(zhǎng)溫度轉(zhuǎn)變?yōu)?2°C后，雖然初始時(shí)細(xì)胞依然能維持棒狀，但細(xì)胞長(zhǎng)度卻變的比野生型的細(xì)胞短很多；隨著在42°C生長(zhǎng)時(shí)間的增加，細(xì)胞逐漸開(kāi)始變?yōu)榍蛐?，并且時(shí)間越長(zhǎng)球形細(xì)胞所占的比例越大。 9.應(yīng)用氣相色譜對(duì)細(xì)胞壁糖組分的分析及應(yīng)用高效液相Dionex陰離子交換層析對(duì)阿拉伯糖組分分析mc<'2>155 glm

16、U KOT菌株生長(zhǎng)在30°C至其吸光度值為0　09后，轉(zhuǎn)移到42°C生長(zhǎng)3天，提取細(xì)菌細(xì)胞壁的核心組分-分枝菌酸-聚阿拉伯半乳糖-肽聚糖(mycolic acid，arabinogalactan，peptidoglycan，mAGP)，然后應(yīng)用氣相色譜(GasChromatography，GC)分析mAGP中糖的組成成分。本實(shí)驗(yàn)中以mc<'2>155 glmUKOT菌株生長(zhǎng)在30°C的細(xì)菌作為對(duì)照。GC結(jié)果表明，在活性GlmU缺失的mc

17、<'2>155 glmU KOT菌株的mAGP中，阿拉伯糖含量明顯增加，半乳糖含量略有增加但不明顯;對(duì)照菌株與mc<'2>155野生型菌株相比沒(méi)有顯著不同。 用堿裂解法移除mAGP中的分枝菌酸和肽聚糖，使之成為可溶性的聚阿拉伯半乳糖(arabinogalactan，AG)。采用來(lái)自纖維單胞菌(Cellumonas gelida)的阿拉伯糖內(nèi)切酶消化可溶性AG，并應(yīng)用Dionex陰離子交換層析柱分析被內(nèi)切酶消化的樣品，結(jié)果表明，m