murA基因?qū)Ψ种U菌生長相關(guān)性在研究.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，TB)是一種具有致病性的病原菌，它所引起的具有傳染性的結(jié)核病已成為對人類健康最大威脅之一。目前，由于多重耐藥性菌株的出現(xiàn)，使結(jié)核病的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈上升趨勢。因此，當前尋找能有效對抗這種病原菌的藥物靶點，并以此來研發(fā)新型抗結(jié)核病藥物已成為試圖控制結(jié)核病蔓延的研究重點。
　　 分枝桿菌細胞壁的核心結(jié)構(gòu)mAGP(mycolic acid，arabinogalac

2、tan，peptidoglycan)由分枝菌酸，聚阿拉伯半乳糖(AG)和肽聚糖(PG)構(gòu)成。其中，肽聚糖是維持菌體細胞形態(tài)和滲透壓平衡的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。肽聚糖是N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸交替連接形成的多糖鏈再與短肽交叉連接形成的網(wǎng)狀大分子結(jié)構(gòu)。其中，N-乙酰胞壁酸以UDP-乙酰胞壁酸作為糖基供體，而UDP-乙酰胞壁酸的合成途徑由兩個酶(MurA和MurB)催化完成。在哺乳動物中不存在N-乙酰胞壁酸，所以，不存在UDP-乙酰胞壁酸代謝途徑。

3、因此，MurA和MurB可能是抗結(jié)核藥物的作用靶點。
　　 本課題組已鑒定了結(jié)核分枝桿菌Rv1315是編碼UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮轉(zhuǎn)移酶(MurA)的murA基因，催化UDP-乙酰胞壁酸生成的第一步反應。為了研究murA基因?qū)Ψ种U菌生長相關(guān)性，本課題利用與結(jié)核分枝桿菌具有相同細胞壁結(jié)構(gòu)，但無致病性的恥垢分枝桿菌(Mycobacterium smegmatis，Msm)mc2155作為實驗模型，構(gòu)建murA基因敲除菌株。<

4、br>　　 本論文的研究目的：(1)采用同源重組插入突變的方法構(gòu)建恥垢分枝桿菌murA基因敲除菌株；(2)在不同條件下對該菌株進行培養(yǎng)，繪制該菌株生長曲線，從而確定murA基因?qū)Ψ种U菌生長的相關(guān)性。
　　 本論文獲得的結(jié)果：
　　 1．Msm murA基因的擴增與克隆
　　 利用PCR(polymerase chain reaction)技術(shù)從mc2155基因組中擴增Msm murA基因及其上游約463bp的

5、DNA序列，并將其連接到pMD18-T的克隆質(zhì)粒上，構(gòu)建出pMD-Msm murA。經(jīng)DNA序列測定，將測序結(jié)果與已知的Msm murA基因進行相似性比較，結(jié)果顯示出擴增的基因為目的基因。
　　 2．條件性復制質(zhì)粒pPR27-Msm murA::kanR的構(gòu)建
　　 將來自于pUC4K的kanR抗性片段插入到克隆質(zhì)粒pMD-Msm murA中的特定位點，產(chǎn)生Msm murA::kanR突變基因。再將Msm murA::k

6、anR突變基因克隆到pPR27-xylE質(zhì)粒，從而構(gòu)建出條件性復制質(zhì)粒pPR27-Msm murA::kanR，該質(zhì)粒具備pPR27-xylE質(zhì)粒的性質(zhì)。
　　 3．營救質(zhì)粒pCG76-Mtb murA的構(gòu)建
　　 從本實驗室構(gòu)建的pET29b-Mtb murA質(zhì)粒中獲得M tuberculosis murA基因，將該基因插入到pET23b-Phsp60質(zhì)粒中，獲得Phsp60-Mtb murA片段。將該片段克隆到pCG

7、76質(zhì)粒，從而構(gòu)建出營救質(zhì)粒pCG76-Mtb murA，該質(zhì)粒具備pCG76質(zhì)粒的性質(zhì)，Mtb murA基因的表達受Phsp60啟動子控制，用于補償murA基因敲除菌株中murA的功能和確定murA基因?qū)Ψ种U菌生長的相關(guān)性。
　　 4．發(fā)生第一次同源重組的突變菌株mc2155 murA TW-1的篩選
　　 將條件性復制質(zhì)粒pPR27-Msm murA::kanR電轉(zhuǎn)化到mc2155感受態(tài)細胞中，根據(jù)pPR27-Ms

8、m murA::kanR質(zhì)粒在30℃條件下能復制，而在42℃條件下不能復制的性質(zhì)，利用溫度壓力在42℃條件下培養(yǎng)攜帶pPR27-Msm murA::kanR質(zhì)粒的mc2155菌株。利用Southern blotting及PCR的方法篩選發(fā)生第一次同源重組(pPR27-Msm murA::kanR質(zhì)粒與mc2155基因組之間)的mc2155 murA TW-1菌株。
　　 5．發(fā)生第二次同源重組的突變菌株mc2155 murA T

9、W-2（即murA基因敲除菌株）的篩選
　　 將營救質(zhì)粒pCG76-Mtb murA電轉(zhuǎn)化到mc2155 murATW-1感受態(tài)細胞中，在30℃條件下，利用含10％蔗糖的選擇性LB培養(yǎng)基培養(yǎng)mc2155 murA TW-1/pCG76-Mtb murA，在蔗糖選擇壓力下，用Southern blotting及PCR的方法篩選發(fā)生第二次同源重組(mc2155 murA TW-1基因組之內(nèi))的菌株mc2155 murA TW-2，即

10、murA基因敲除菌株。
　　 在30℃條件下，營救質(zhì)粒pCG76-Mtb murA可以在murA基因敲除菌株中表達出Mtb MurA蛋白質(zhì)，從而補償缺失murA基因的功能。
　　 6．生長曲線的測定
　　 在30℃和42℃條件下，每隔24小時測定murA基因敲除菌株在595 nm處的光吸收值，并繪制生長曲線。以野生型M.smegmatis作為對照組。實驗結(jié)果表明對照組在30℃和42℃條件下均能生長；而murA基因

11、敲除菌株僅能在30℃條件下生長，在42℃條件下不能生長，從而說明murA基因是分枝桿菌生長必需基因。
　　 7．溫度轉(zhuǎn)換后生長曲線的繪制
　　 將murA基因敲除菌株接種到含相應抗生素(30℃:Kan和Str;轉(zhuǎn)換42℃:Kan)和0.05%Tween80的LB液體培養(yǎng)基中，先在30℃振蕩培養(yǎng)至一定濃度時，將只含有Kan的培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到42℃生長；另外，含有Kan和Str的培養(yǎng)基繼續(xù)在30℃培養(yǎng)作為對照。每24小時測定細菌

12、在595nm處的吸光度值，繪制細菌的溫度轉(zhuǎn)換生長曲線。溫度轉(zhuǎn)換生長曲線結(jié)果進一步說明murA基因是分枝桿菌生長生長必需基因。
　　 結(jié)論：
　　 本研究利用與結(jié)核分枝桿菌具有相同細胞壁結(jié)構(gòu)，但無致病性的恥垢分枝桿菌mc2155菌株作為實驗模型，利用同源DNA重組技術(shù)構(gòu)建了murA基因敲除菌株。根據(jù)其在30℃和42℃的生長曲線，確定了murA基因是分枝桿菌生長必需基因；溫度轉(zhuǎn)換生長曲線的結(jié)果也進一步確定了murA基因為分枝