肉桂醛促進(jìn)高糖條件下皮膚成纖維細(xì)胞遷移及機(jī)制研究.pdf

1、糖尿病潰瘍(Diabetes ulcers，DUs)具有較高的發(fā)病率和復(fù)發(fā)率，并因其復(fù)雜的異常病理生理學(xué)過(guò)程而難以愈合，已經(jīng)成為非創(chuàng)傷性截肢的主要原因。 DUs遷延不愈，最終導(dǎo)致截肢，降低患者生活質(zhì)量，增加患者死亡率和醫(yī)療費(fèi)用。然而，DUs發(fā)病的分子和遺傳機(jī)制尚不清楚，治療方案仍需進(jìn)一步研究探討。因此，深入研究DUs愈合的機(jī)制和治療方案越來(lái)越受到人們的廣泛關(guān)注。
　　近來(lái)研究證實(shí)，多種因素（慢性炎癥、持續(xù)高血糖等）增加體內(nèi)活性氧(

2、Reactiveoxygen species，ROS)的水平，加劇氧化應(yīng)激(oxidative Stress，OS)損傷，導(dǎo)致糖尿病創(chuàng)口遷延不愈。核因子E2相關(guān)因子（nuclear factor erythroid2-related factor，NRF2）是氧化還原敏感轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)調(diào)控其下游數(shù)十種抗氧化酶和Ⅱ相解毒酶的表達(dá)，中和過(guò)多的ROS，減輕OS損傷，在維持細(xì)胞氧化還原平衡中扮演舉足輕重的作用，更有望成為臨床治療DUs的新靶點(diǎn)。

3、本課題組長(zhǎng)期致力于NRF2領(lǐng)域相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)NRF2在糖尿病腎病以及糖尿病骨骼肌病變中的保護(hù)作用。近期，我們的研究進(jìn)一步證實(shí)糖尿病患者足部潰瘍周?chē)つw存在嚴(yán)重的氧化應(yīng)激損傷，藥理激活NRF2通路可以促進(jìn)皮膚角質(zhì)細(xì)胞遷移，顯著改善糖尿病創(chuàng)口愈合。
　　長(zhǎng)期以來(lái)，桂皮一直作為中藥或者調(diào)味料被廣泛使用，其主要活性成分是肉桂醛(cinnamicaldehyde，CA)。現(xiàn)今許多研究證實(shí)CA具有廣泛的生物和藥理活性。近來(lái)，我們的前期研究證實(shí)

4、，CA作為一種特異性NRF2激動(dòng)劑，顯著促進(jìn)角質(zhì)細(xì)胞遷移，緩解氧化應(yīng)激損傷，改善STZ誘導(dǎo)的糖尿病鼠創(chuàng)口愈合。基于上述研究結(jié)果我們擬進(jìn)一步探索CA是否可能通過(guò)激活NRF2通路從而調(diào)控參與創(chuàng)口愈合另一重要細(xì)胞，即皮膚成纖維細(xì)胞的遷移、增殖等功能。因此本研究擬觀察CA對(duì)高糖條件下皮膚成纖維細(xì)胞(HS27)功能的影響，并探討NRF2在其中的作用，為CA應(yīng)用于DUs治療進(jìn)一步提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　目的：
　　1、觀察CA對(duì)高糖情況下皮

5、膚成纖維細(xì)胞遷移的影響;
　　2、探討NRF2通路在成纖維細(xì)胞遷移中的作用;
　　3、探討CA對(duì)成纖維細(xì)胞遷移的作用機(jī)制。
　　材料和方法：
　　實(shí)驗(yàn)材料:
　　人皮膚成纖維細(xì)胞系HS27獲贈(zèng)于亞利桑那癌癥中心Dr.Tim Bowden教授;CA購(gòu)自Sigma公司。
　　實(shí)驗(yàn)分組:正常糖(normal glucose，NG，5.5mmol/L)組，高糖(high glucose，HG，30mmol/L

6、)組，(HG+CA)組，(HG+ConsiRNA)組，(HG+NRF2siRNA)組，CA濃度20μmol/L。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1、遷移實(shí)驗(yàn)觀察CA或阻斷NRF2通路后對(duì)高糖情況下HS27細(xì)胞遷移的影響;
　　實(shí)驗(yàn)前，預(yù)先在待接種細(xì)胞的6孔板中準(zhǔn)備經(jīng)紫外線消毒的聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)膜。HS27細(xì)胞在NG或HG中培養(yǎng)2天后，HG組加入20μmol/L CA干預(yù)24h后

7、移去PDMS膜。于0h，24h，48h，60h，72h拍照實(shí)時(shí)記錄細(xì)胞遷移情況。進(jìn)一步進(jìn)行siRNA干擾實(shí)驗(yàn)，HS27細(xì)胞接種于6孔板，分別轉(zhuǎn)染ConsiRNA或NRF2siRNA，生長(zhǎng)48h后，待細(xì)胞融合成單層細(xì)胞如上述方法觀察細(xì)胞遷移情況。
　　2、WB檢測(cè)CA對(duì)HS27細(xì)胞NRF2通路及增殖、凋亡相關(guān)蛋白的影響，干擾NRF2通路后對(duì)HS27細(xì)胞增殖、凋亡相關(guān)蛋白的影響
　　按照實(shí)驗(yàn)分組:HG組，(HG+CA)組;(HG

8、+ConsiRNA)組，（HG+NRF2siRNA）組，HS27細(xì)胞培養(yǎng)48h后提取蛋白，WB檢測(cè)NRF2，HO-1，P53，P21的表達(dá)。
　　3、DCF探針?lè)z測(cè)CA對(duì)高糖條件下HS27細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響，干擾NRF2通路后對(duì)HS27細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化的影響
　　按照實(shí)驗(yàn)分組:陰性對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組，NG組，HG組，(HG+CA)組;(HG+ConsiRNA)組，(HG+NRF2siRNA)組。HS27細(xì)胞培養(yǎng)48

9、h后，應(yīng)用HBSS緩沖鹽溶液洗滌細(xì)胞2次后，換用含10μg/mL DCF的HBSS緩沖鹽溶液在37℃培養(yǎng)箱避光孵育30min。然后HBSS緩沖鹽溶液洗滌3次后置于熒光顯微鏡(Zeiss Observer.Z1)下采用激發(fā)波長(zhǎng)和放射波長(zhǎng)為485nm和530nm之間檢測(cè)熒光強(qiáng)度。采用Slidebook5.0軟件分析熒光圖像。運(yùn)用Image J software分析每組隨機(jī)3個(gè)區(qū)域的相對(duì)熒光強(qiáng)度從而代表細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。
　　結(jié)果：<

10、br>　　1、CA顯著促進(jìn)高糖條件下HS27細(xì)胞的遷移
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)NG組，HG組和(HG+CA)組的HS27細(xì)胞在前24h的遷移并無(wú)明顯差異。然而，48h時(shí)，與NG組相比，HG組HS27細(xì)胞遷移顯著受阻，給予CA干預(yù)后，(HG+CA)組HS27細(xì)胞遷移得到顯著改善。60h時(shí)，與NG組相比，HG組HS27細(xì)胞遷移顯著受阻。觀察至72h，NG組已完全愈合，HG組僅約70％的愈合率，(HG+CA)組幾乎完全愈合;進(jìn)一步，為驗(yàn)證NR

11、F2是否參與CA促進(jìn)高糖條件下HS27細(xì)胞遷移過(guò)程，干擾NRF2后觀察HS27細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果顯示前48h(HG+NRF2siRNA)組與(HG+ConsiRNA)組HS27細(xì)胞遷移并無(wú)顯著差異，60h時(shí)，與(HG+ ConsiRNA)組相比，(HG+ NRF2siRNA)組HS27細(xì)胞遷移顯著減弱。72h時(shí)，(HG+ ConsiRNA)組細(xì)胞間隙完全愈合，(HG+NRF2 siRNA)組仍有約24％未愈合，提示阻斷NRF2通路抑制

12、HS27細(xì)胞遷移
　　2、CA激活HS27細(xì)胞NRF2通路，但并不影響細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白P21、P53的表達(dá)水平
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(HG+CA)組NRF2及其下游HO-1表達(dá)水平顯著升高，然而與HG組相比，(HG+CA)組HS27細(xì)胞的P21和P53表達(dá)水平并無(wú)顯著改變，表明CA激活高糖條件下HS27細(xì)胞的NRF2通路，但并不影響細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白P21、P53的表達(dá)水平;進(jìn)一步，干擾NRF2后檢測(cè)HS27細(xì)胞增殖和

13、凋亡相關(guān)蛋白P21和P53表達(dá)水平變化，結(jié)果顯示與(HG+ ConsiRNA)組相比，(HG+NRF2siRNA)組NRF2、HO-1的表達(dá)顯著降低，而增殖和凋亡相關(guān)蛋白P21和P53表達(dá)水平并無(wú)改變，表明阻斷NRF2通路，并不影響HS27細(xì)胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白P21和P53的表達(dá)水平。
　　3、CA顯著降低高糖條件下HS27細(xì)胞內(nèi)ROS水平
　　經(jīng)定量分析，HG組和(HG+CA)組的相對(duì)熒光強(qiáng)度均以NG組平均熒光強(qiáng)度值作為

14、標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比分析。與NG組相比，HG組ROS水平顯著升高，而經(jīng)CA干預(yù)后其ROS水平較HG組顯著降低，提示CA可以抑制高糖導(dǎo)致的HS27細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高;進(jìn)一步，干擾NRF2加劇HS27細(xì)胞內(nèi)ROS水平的升高，采用DCF法檢測(cè)(HG+NRF2siRNA)組和(HG+ ConsiRNA)組細(xì)胞內(nèi)ROS水平，與(HG+ConsiRNA)相比，(HG+NRF2siRNA)組ROS水平顯著升高，提示NRF2通路是調(diào)節(jié)高糖條件下ROS水平升高的重

15、要因素。
　　結(jié)論：
　　1、高糖導(dǎo)致成纖維細(xì)胞遷移能力顯著降低，而肉桂醛減輕高糖對(duì)成纖維細(xì)胞遷移的抑制作用;高糖情況下阻斷NRF2通路后，成纖維細(xì)胞的遷移受阻進(jìn)一步加重。提示CA促進(jìn)高糖條件下的成纖維細(xì)胞遷移，而NRF2通路在成纖維細(xì)胞遷移中可能具有重要調(diào)控作用。
　　2、肉桂醛激活高糖條件下成纖維細(xì)胞NRF2通路及其下游HO-1，但并不影響增殖和凋亡相關(guān)蛋白P21、P53的表達(dá)變化。
　　3、高糖增加HS27

16、細(xì)胞內(nèi)的ROS水平，肉桂醛可以顯著抑制高糖誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞內(nèi)ROS的生成;進(jìn)一步，干擾NRF2后，高糖情況下成纖維細(xì)胞內(nèi)的ROS水平進(jìn)一步升高。提示肉桂醛可能通過(guò)NRF2通路減輕高糖誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞內(nèi)ROS水平。
　　綜上，肉桂醛明顯促進(jìn)高糖條件下成纖維細(xì)胞遷移，雖然并不影響成纖維細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)水平，但是肉桂醛顯著激活NRF2通路，抑制高糖誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高。因此，肉桂醛促進(jìn)高糖條件下成纖維細(xì)胞遷移，其機(jī)