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1、水通道蛋白3(Aquaporin3,AQP3)是一種能快速跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水、甘油和尿素等小分子物質(zhì)的膜整合蛋白,在皮膚的屏障功能、水的保存中起重要作用。AQP3不但參與細(xì)胞的增殖、分化與遷移,與皮膚細(xì)胞的衰老相關(guān),而且還能夠通過(guò)調(diào)節(jié)H2O2的透膜吸收,進(jìn)而影響細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)。
自噬是細(xì)胞內(nèi)主要的異化途徑,維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài),參與衰老以及與衰老相關(guān)的各種生理病理過(guò)程。但隨著年齡的增長(zhǎng),細(xì)胞內(nèi)自噬功能逐漸減弱,導(dǎo)致細(xì)胞適應(yīng)外界環(huán)境和自身
2、防御反應(yīng)的能力降低,細(xì)胞穩(wěn)態(tài)發(fā)生變化。細(xì)胞光老化過(guò)程中,UVA輻射細(xì)胞產(chǎn)生的ROS可誘導(dǎo)自噬及細(xì)胞衰老,而衰老的細(xì)胞中,自噬功能減弱,ROS對(duì)細(xì)胞造成的損傷得不到清除而不斷積累,進(jìn)一步加重細(xì)胞衰老。而H2O2作為ROS的重要組成成分,可被AQP3跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),由此,我們推測(cè):AQP3與自噬在NHSFs光老化過(guò)程中可能存在某些聯(lián)系。
本研究的第一部分中,我們首先采用組織塊真表皮分離法原代培養(yǎng)正常人皮膚成纖維細(xì)胞(NHSFs),利用3
3、20-400nm波長(zhǎng)范圍的UVA輻射NHSFs,構(gòu)建光老化細(xì)胞模型。再行慢病毒轉(zhuǎn)染AQP3shRNA和AQP3cDNA質(zhì)粒,成功構(gòu)建不同AQP3表達(dá)量的NHSFs穩(wěn)定細(xì)胞株。最后行β-半乳糖苷酶染色、Western-blot(WB)和RT-PCR等技術(shù)檢測(cè)衰老相關(guān)指標(biāo)及光老化過(guò)程中AQP3水平的變化;行透射電鏡、免疫熒光染色(IF)以及Western-blot等技術(shù)檢測(cè)自噬水平。研究發(fā)現(xiàn):(1)小劑量UVA單次輻射NHSFs,不能誘導(dǎo)細(xì)
4、胞衰老,但AQP3表達(dá)增高;小劑量UVA重復(fù)5天輻射NHSFs,可誘導(dǎo)細(xì)胞衰老,此時(shí)AQP3表達(dá)下降;(2)降低表達(dá)AQP3的NHSFs出現(xiàn)衰老表型,接受小劑量的UVA單次輻射可加重衰老;而過(guò)表達(dá)AQP3可使NHSFs在接受小劑量UVA重復(fù)5天的劑量輻射時(shí)的衰老減輕;(3)小劑量UVA單次輻射NHSFs,細(xì)胞自噬水平增高;小劑量UVA重復(fù)5天輻射NHSFs,自噬水平下降;(4)降低表達(dá)AQP3的NHSFs,自噬水平降低,小劑量的UVA單
5、次輻射可使自噬水平進(jìn)一步降低;而過(guò)表達(dá)AQP3,使NHSFs的自噬水平增加,在接受小劑量UVA重復(fù)5天的劑量輻射時(shí)的亦可減輕自噬水平的降低。該部分研究初步明確了,AQP3通過(guò)影響細(xì)胞自噬,在人皮膚成纖維細(xì)胞光老化過(guò)程中的發(fā)揮保護(hù)性作用。
為進(jìn)一步明確AQP3通過(guò)影響自噬參與細(xì)胞光老化過(guò)程的具體機(jī)制,在第二部分的研究中,我們利用前期構(gòu)建的光老化細(xì)胞模型和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株,使用H2O2抑制劑,以及三條MAPKs途徑中各磷酸化蛋白分
6、子的抑制劑,檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)H2O2水平,以及ERK1/2/、JNK/SAPK、p38MAPK及mTOR磷酸化水平/總蛋白水平以及LC3Ⅱ/Ⅰ和P16INK4a的蛋白表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn):(1)低表達(dá)AQP3的NHSFs,胞內(nèi)H2O2水平增加,低劑量UVA單次輻射即可使胞內(nèi)H2O2水平進(jìn)一步升高,H2O2抑制劑可顯著降低其水平;(2)高表達(dá)AQP3可顯著減少NHSFs在接受低劑量UVA重復(fù)5天輻射時(shí)升高的胞內(nèi)H2O2水平,H2O2抑制劑亦可降
7、低其胞內(nèi)H2O2水平;(3)抑制劑降低胞內(nèi)H2O2水平后,可使MAPKs的JNK/SAPK、P38MAPK、ERK磷酸化水平下降;(4)分別抑制三種MAPKs磷酸化后,只有JNK/SAPK、p38 MAPK抑制劑誘導(dǎo)了LC3Ⅱ/Ⅰ水平增高,P16INK4a表達(dá)下降。說(shuō)明,三條MAPKs途徑中只有JNK/SAPK、p38 MAPK途徑參與了AQP3調(diào)節(jié)自噬和影響光老化的過(guò)程;而AQP3介導(dǎo)的H2O2的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),是活化MAPKs途徑的重要因
8、素。
綜上所述,我們得出如下結(jié)論:UVA輻射NHSFs誘導(dǎo)的胞內(nèi)H2O2聚集可激活MAPKs途徑進(jìn)而影響自噬和衰老,AQP3可通過(guò)調(diào)控H2O2的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn),減輕MAPKs的活化,實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬水平的調(diào)節(jié),從而抵御NHSFs衰老。即:AQP3可通過(guò)影響ROS-MAPKs-mTOR途徑調(diào)節(jié)自噬,從而在人皮膚成纖維細(xì)胞光老化過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)性作用。本研究首次將AQP3引進(jìn)皮膚衰老機(jī)制的研究領(lǐng)域,也是首次發(fā)現(xiàn)AQP3可通過(guò)影響自噬水平延緩細(xì)胞
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