水蛭、斑蝥對腫瘤血管生成及VEGF、MMP表達的影響.pdf

1、腫瘤尤其是惡性腫瘤日益成為危害人類健康的主要殺手，是人類最主要的死亡原因之一。而惡性腫瘤的患者，絕大多數(shù)死于腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致臨床治療失敗，影響腫瘤患者長期生存的主要因素。如何阻斷腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，是防治腫瘤的根本所在。自從“腫瘤生長依賴血管生成”的假說提出之后，腫瘤血管生長的調(diào)節(jié)機制和抗血管生成的研究得到廣泛關(guān)注。斷絕或減少腫瘤血管供應(yīng)、抑制腫瘤血管生成是控制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的重要途徑之一.中藥成分復(fù)雜多樣，對腫瘤血管生成的影

2、響可能是多靶點、多層次的。尋找新的高效低毒血管生成抑制劑，尤其從中藥中篩選出可以抑制新生血管、阻斷腫瘤轉(zhuǎn)移途徑的新藥，已成為當前國內(nèi)外學(xué)者關(guān)心的重要課題。我們的研究選擇了蟲類藥物中抗腫瘤作用明顯的水蛭和斑蝥為切入點進行研究。
　　 目的：
　　 探討中藥水蛭、斑蝥對雞胚絨毛尿囊膜(CAM)血管生成的影響；水蛭、斑蝥對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)的影響；水蛭、斑蝥對小鼠移植肉瘤(S180)血管形成的影響。從血管生長因

3、子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和微血管密度(MVD)等角度出發(fā)研究抑制血管生長的機理，從抗血管生成方面進一步探討水蛭、斑蝥抗腫瘤的作用機制，為臨床中藥治療惡性腫瘤，防止腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移提供實驗依據(jù)，為祖國醫(yī)學(xué)治療惡性腫瘤開辟新的途徑。
　　 方法：
　　 應(yīng)用CAM技術(shù)、免疫組化技術(shù)等，觀察水蛭、斑蝥的含藥血清對CAM血管形成以及對體外培養(yǎng)血管內(nèi)皮細胞的影響，觀察水蛭、斑蝥對小鼠移植腫瘤的影響。實驗分在體實驗研

4、究和離體實驗研究兩部分：
　　 1.在體實驗研究
　　 建立雞胚絨毛尿囊膜模型，觀察水蛭、斑蝥含藥血清對雞胚尿囊膜微血管生長(血管數(shù)目和血管面積)的影響；進行水蛭、斑蝥水煎濃縮液對小鼠移植腫瘤的抗轉(zhuǎn)移觀察，觀察S180腹水瘤小鼠瘤體重量、腫瘤抑制率等。用免疫組化的方法測定腫瘤組織金屬基質(zhì)蛋白酶(MMP)的表達、腫瘤組織血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達、微血管密度(MVD)等指標。
　　 2.離體實驗研究

5、　　 觀察水蛭、斑蝥含藥血清對體外臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)增殖的影響。顯微鏡下觀察細胞的形態(tài)學(xué)改變，并采用MTT法在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定光吸收值(OD值)，測定含藥血清對HUVEC活力的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.發(fā)育6日的雞胚絨毛尿囊膜血管模型較適用于研究藥物對血管生成的影響。水蛭、斑蝥對雞胚絨毛尿囊膜新生血管數(shù)量有明顯的抑制作用(P<0.01)，對于血管面積也有一定的抑制作用。水蛭高劑量組與空白對照組、

6、血清組相比較，有顯著的抑制新血管生成的能力(P<0.01)，水蛭低劑量組與空白對照組相比有一定作用但不顯著((P=0.0814)；斑蝥高低劑量組與空白對照組和血清組相比較，抑制新生血管數(shù)的能力較強，有顯著性差異(P<0.01)；空白對照組和血清組之間沒有差異(P=0.8530)。
　　 水蛭高低劑量組有一定抑制血管面積的作用，但差異不具有顯著性(P=0.4008，0.4173，0.7647，0.8449)；斑蝥高低劑量組有抑制血

7、管面積的作用，其中高劑量組與空白對照組、血清組比較，具有顯著性差異((P=0.0015，0.0006)；低劑量組有一定抑制血管面積的作用但不具有顯著性差異(P=0.1325，0.1192)?？瞻讓φ战M和血清組之間比較沒有顯著性差異(P=0.9003)。水蛭和斑蝥的高劑量組相比有差異，斑蝥的抑制作用更明顯(P=0.0065)。
　　 2.與對照組比較，水蛭高低劑量組和斑蝥高低劑量組對小鼠移植腫瘤均有明顯的抑制作用，瘤重明顯減輕，(

8、P=0.0118，0.0013，0.0001，0.0002)；水蛭高低劑量和斑蝥高低劑量組的抑瘤率與對照組相比，均為P<0.01。
　　 水蛭、斑蝥對S180瘤體微血管密度(MVD)的影響顯示：斑蝥高低劑量組、水蛭高劑量組微血管數(shù)目減少較明顯(P=0.0252，P=0.0024和P=0.0483)。免疫組化結(jié)果顯示，VEGF蛋白在S180肉瘤組織中呈高表達，各用藥組對VEGF的表達有不同程度的抑制作用，斑蝥高低劑量組和水蛭高劑量

9、組對VEGF的表達有較明顯的抑制作用(P=0.0145，0.0420，0.0023)。實驗結(jié)果還顯示對照組MMP-9呈高表達，而水蛭、斑蝥高低劑量組MMP-9呈低表達，具有顯著性差異(P=0.0011，0.0016，0.0224，0.0078)。
　　 3.與對照組相比較，水蛭、斑蝥含藥血清各組對體外臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)的增殖具有一定的抑制作用。MTT法測定含藥血清對HUVEC增殖作用的影響結(jié)果顯示：斑蝥高、中、低劑

10、量組吸光度(OD值)與對照組比較有顯著性差異(P=5.7706E-09，0.003534，2.3148E-06)，且隨著濃度的升高其抑制作用更加明顯，呈很好的劑量依賴關(guān)系；水蛭高中劑量組吸光度(OD值)與對照組比較有顯著性差異(P=1.2854E-05，0.025)。細胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：未經(jīng)處理的正常對照組細胞形態(tài)正常，細胞呈梭形狀，完整，未見凋亡細胞。而斑蝥高、中、低劑量組細胞體積皺縮變小，甚至細胞破裂或死亡，細胞密度明顯下降。水蛭高

11、中劑量組亦可見明顯的細胞體積縮小，甚至細胞破裂或死亡，細胞密度明顯下降。
　　 結(jié)論：
　　 1.水蛭、斑蝥對雞胚絨毛尿囊膜新生血管有一定的抑制作用。
　　 2.水蛭、斑蝥可抑制小鼠S180肉瘤的生長，降低S180肉瘤組織中血管內(nèi)皮生成因子(VEGF)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達，降低S180肉瘤組織的微血管密度(MVD)。
　　 3.水蛭、斑蝥可一定程度抑制臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)的增