構(gòu)建BMSCs-慶大霉素-藻酸鈣三維緩釋微球的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨著醫(yī)學(xué)科學(xué)發(fā)展，人們對(duì)生活質(zhì)量期望值的提高，關(guān)節(jié)感染是許多關(guān)節(jié)外科醫(yī)生亟需解決的問(wèn)題，特別是嚴(yán)重的關(guān)節(jié)感染，同時(shí)合并有大量的關(guān)節(jié)軟骨損傷或是大面積軟骨剝脫傷。關(guān)節(jié)感染以及軟骨損傷修復(fù)的難度在于：關(guān)節(jié)腔是存在極低循環(huán)的密閉腔室，全身應(yīng)用抗生素的血藥濃度對(duì)于關(guān)節(jié)腔內(nèi)細(xì)菌的作用是微乎其微，局部注射抗生素也存在導(dǎo)致外源性感染的可能性以及細(xì)菌耐藥，反復(fù)的注射疼痛也讓病人望而生畏；由于關(guān)節(jié)軟骨具有無(wú)神經(jīng)支配、缺乏血液供應(yīng)、軟骨細(xì)胞增殖遷移能力低等

2、組織學(xué)特點(diǎn)，關(guān)節(jié)軟骨自身修復(fù)能力非常有限。關(guān)節(jié)面軟骨組織損傷后之所以難以自行修復(fù)，是因?yàn)檐浌羌?xì)胞在體內(nèi)缺乏增殖能力。因此本課題通過(guò)構(gòu)建BMSCs-慶大霉素-藻酸鹽三維共培養(yǎng)體系，通過(guò)大體觀察，H-E 染色、甲苯胺藍(lán)染色、Ⅱ型膠原染色、微生物法等檢測(cè)方法，了解三維凝珠慶大霉素的緩釋情況，觀察BMSCs的細(xì)胞形態(tài)、增殖能力及表型的變化，以及慶大霉素對(duì)BMSCs細(xì)胞和軟骨細(xì)胞增殖及分化的影響。
　　 目的：構(gòu)建BMSCs-慶大霉素-藻

3、酸鹽三維共培養(yǎng)體系，檢測(cè)三維緩釋凝珠慶大霉素的釋放情況，觀察BMSCs的細(xì)胞形態(tài)、增殖能力及表型的變化，以及慶大霉素對(duì)BMSCs細(xì)胞和軟骨細(xì)胞增殖及分化的影響。
　　 方法：1、采用貼壁篩選法從兔骨髓組織中分離、純化BMSCs，進(jìn)行體外平面培養(yǎng)擴(kuò)增，應(yīng)用H-E 染色、免疫組化CD34、CD44、CD105抗體染色等方法對(duì)細(xì)胞表型、純度進(jìn)行鑒定。2、采用藻酸鹽凝膠與BMSCs構(gòu)建三維共培養(yǎng)體系，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)、繪制生長(zhǎng)曲線、H-E

4、染色、甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色等觀察藻酸鹽三維凝膠中細(xì)胞生物學(xué)性狀的變化。3、構(gòu)建慶大霉素-藻酸鈣三維緩釋凝珠U、S、T 共3組，通過(guò)紫外分光光度法及微生物法檢測(cè)釋放的藥物濃度及持續(xù)時(shí)間，計(jì)算藥物累積釋放量與各時(shí)間段的點(diǎn)釋放量，并與含慶大霉素的骨水泥Y組作比較，尋找合適的濃度配比，使慶大霉素的釋放更加穩(wěn)定持久。4、構(gòu)建BMSCs-慶大霉素-藻酸鹽三維緩釋共培養(yǎng)體系，通過(guò)細(xì)胞計(jì)數(shù)、繪制生長(zhǎng)曲線、H-E 染色、甲苯胺藍(lán)染色和Ⅱ型膠

5、原免疫組化染色等觀察BMSCs的細(xì)胞形態(tài)、增殖能力及表型的變化，以及慶大霉素對(duì)BMSCs細(xì)胞和軟骨細(xì)胞增殖及分化的影響。
　　 結(jié)果：1、培養(yǎng)的BMSCs 貼壁能力很強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)為短梭形或紡錘形，細(xì)胞形態(tài)、大小相近；采用免疫細(xì)胞化學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的第1-3代細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞表面抗原CD44、CD105，不表達(dá)CD34；同時(shí)，Ⅱ型膠原免疫組化染色陰性，顯示所培養(yǎng)的細(xì)胞為未分化的BMSCs。2、藻酸鹽凝膠具有一定的彈性和強(qiáng)度及良好的組織相

6、容性，BMSCs在藻酸鹽凝珠中具有良好的生物學(xué)活性；經(jīng)過(guò)2周以上的藻酸鹽三維凝珠培養(yǎng)，免疫組化鑒定發(fā)現(xiàn)支架細(xì)胞的Ⅱ型膠原染色陽(yáng)性、甲苯胺藍(lán)染色也呈陽(yáng)性改變，說(shuō)明藻酸鹽三維培養(yǎng)微環(huán)境可誘導(dǎo)BMSCs 定向分化成軟骨細(xì)胞。3、U組慶大霉素-藻酸鈣三維緩釋凝珠的慶大霉素累積釋放量與慶大霉素骨水泥Y組沒(méi)有顯著性差異，與S、T組有顯著性差異，釋放情況優(yōu)于S、T組，S、T組間無(wú)顯著性差異。U組各時(shí)間段的點(diǎn)釋放量與Y組有顯著性差異，與S、T組有顯著性

7、差異，S、T組間無(wú)顯著性差異。從各時(shí)間段的點(diǎn)釋放量與時(shí)間的曲線圖可以看出U、Y組整體釋放較為接近，而U組早期(前24h)的藥物釋放要大于Y組和S、T組。各組在30天的檢測(cè)時(shí)間里都能檢測(cè)出藥物的釋放，且大于最小抑菌濃度。4、BMSCs在構(gòu)建BMSCs-慶大霉素-藻酸鹽三維緩釋共培養(yǎng)體系中具有良好的生物學(xué)活性；經(jīng)過(guò)大體觀察，倒置顯微鏡觀察BMSCs的生長(zhǎng)情況良好，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線基本正常，經(jīng)過(guò)2周以上的藻酸鹽三維凝珠培養(yǎng)，免疫組化鑒定發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的

8、Ⅱ型膠原染色陽(yáng)性，甲苯胺藍(lán)染色也呈陽(yáng)性改變，呈軟骨細(xì)胞表型。
　　 結(jié)論：1. 實(shí)驗(yàn)采用貼壁篩選法分離、純化兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)免疫組化檢測(cè)CD34、CD44、CD105抗體免疫組化染色陽(yáng)性，Ⅱ型膠原抗體免疫組化染色陰性，符合BMSCs的特點(diǎn)，證明通過(guò)該方法可以成功獲取到高純度、未分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。2.構(gòu)建BMSCs-藻酸鹽天然支架材料三維立體培養(yǎng)體系，經(jīng)過(guò)大體觀察，倒置顯微鏡觀察BMSCs的生長(zhǎng)情況，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制

9、，證實(shí)BMSCs在該支架材料三維立體生長(zhǎng)增殖良好，培養(yǎng)第7-21天細(xì)胞增殖明顯，較平面培養(yǎng)獲得更多的細(xì)胞量，為BMSCs 提供良好的生長(zhǎng)微環(huán)境，并且BMSCs 可以保持良好的生物學(xué)形態(tài)，于培養(yǎng)2周時(shí)能夠分化為軟骨細(xì)胞，經(jīng)免疫組化檢測(cè)Ⅱ型膠原抗體免疫組化染色陽(yáng)性，甲苯胺藍(lán)染色呈陽(yáng)性改變。3、慶大霉素-藻酸鈣三維緩釋凝珠能夠長(zhǎng)期持久的釋放慶大霉素，并在局部達(dá)到最小抑菌濃度。在30天的檢測(cè)時(shí)間里，按U組配制方案獲得的藻酸鈣凝珠包封率達(dá)53.9