以海藻酸三維支架構(gòu)建MSC源性人工肝組織的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:肝臟在人體內(nèi)擔(dān)負(fù)著復(fù)雜的生理功能，對(duì)維持生命和內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定起重要的作用。然而，急性肝衰竭、肝硬化等終未期肝病目前仍是醫(yī)學(xué)界難以解決的問(wèn)題，死亡率非常高。我國(guó)是肝病大國(guó)，每年因肝病死亡者人數(shù)眾多。目前肝移植雖然是治療各種終末期肝病的有效方法，但是存在供體來(lái)源困難、手術(shù)復(fù)雜、患者需終生接受免疫抑制治療、費(fèi)用昂貴等缺點(diǎn)，無(wú)法廣泛開展。肝組織工程的研究和進(jìn)展給終末期肝病的治療帶來(lái)了新的希望。肝組織工程即把合適的種子細(xì)胞與生物支架材料相結(jié)合

2、，在一定的微環(huán)境下，經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)培養(yǎng)，形成一定量的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞和組織，再移植到患者體內(nèi)以修復(fù)或替代肝臟的功能；其最終目標(biāo)是構(gòu)建一個(gè)完整的、有功能的、可移植的肝臟。 肝組織工程研究的首要任務(wù)就是選擇可靠的并能提供足夠數(shù)量的種子細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞由于倫理問(wèn)題，其研究和應(yīng)用受到一定限制；肝細(xì)胞株和肝干細(xì)胞因其具有成瘤傾向而不適宜體內(nèi)移植；成熟肝細(xì)胞也有細(xì)胞獲取難度較大、異基因肝細(xì)胞可能產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)、體外培養(yǎng)易失去活性與功能等諸多不足，不能

3、成為滿意的種子細(xì)胞。近年來(lái)，有關(guān)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(bonemesenchymalstemcell，MSC)的研究給肝組織工程種子細(xì)胞帶來(lái)了新的選擇。 MSC是骨髓基質(zhì)細(xì)胞的重要組成成分，不但與其他細(xì)胞一起支持造血干細(xì)胞造血，同時(shí)還表現(xiàn)出較強(qiáng)的可塑性，在不同的誘導(dǎo)條件下.能夠分化為多種組織細(xì)胞；同時(shí)MSC還具有分離培養(yǎng)容易、體外可大量擴(kuò)增、遺傳背景相對(duì)穩(wěn)定、體內(nèi)植入反應(yīng)弱、易于接受外源基因的導(dǎo)入和表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)。目前雖然已有眾多的研究證

4、明在體內(nèi)MSC是肝臟修復(fù)過(guò)程中重要的肝外來(lái)源，在體外MSC也能在平面上被誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞，然而MSC要成為肝組織工程的種子細(xì)胞則必須與生物支架結(jié)合，并在立體結(jié)構(gòu)上成肝誘導(dǎo)，這方面鮮有報(bào)導(dǎo)。因此研究MSC在三維立體支架上的成肝誘導(dǎo)方法，使MSC成為肝組織工程的種子細(xì)胞，同時(shí)將擴(kuò)增的MSC及支架復(fù)合物在體外重塑形成具有一定功能的肝組織，或是進(jìn)行體內(nèi)移植以替代損傷的肝細(xì)胞，不僅具有非常重要的理論意義，也具有良好的臨床應(yīng)用前景。 肝組織

5、工程的另一個(gè)研究?jī)?nèi)容即研發(fā)合適的支架材料。由于肝組織是代謝性軟組織，它對(duì)材料的力學(xué)性能要求與骨組織相比要低得多，而對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的生物活性及微環(huán)境仿生要求更高。從這個(gè)意義上來(lái)講，諸如海藻酸、殼聚糖、膠原、纖維連接蛋白、層連蛋白、透明質(zhì)酸等天然基質(zhì)材料更適用于肝組織工程。海藻酸是從褐藻中提取的一種酸性多糖，由古洛糖醛酸與甘露糖醛酸組成的嵌段聚合物，可與二價(jià)金屬離子偶聯(lián)形成水凝膠。海藻酸支架具有良好的親水特性，疏松多孔的立體結(jié)構(gòu)和優(yōu)越的組

6、織相容性，已經(jīng)被作為細(xì)胞載體在組織工程研究包括肝組織工程上廣泛應(yīng)用。 本研究擬通過(guò)構(gòu)建海藻酸支架—MSC復(fù)合物，并在立體結(jié)構(gòu)上誘導(dǎo)MSC向肝細(xì)胞分化來(lái)探討在體外構(gòu)建MSC源性的人工肝組織的可能性；同時(shí)將其移植到肝功能不全大鼠體內(nèi)來(lái)檢測(cè)此復(fù)合物是否能夠在肝功能不全大鼠體內(nèi)能否實(shí)現(xiàn)肝臟功能的支持作用，為MSC和海藻酸支架在肝組織工程的進(jìn)一步應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 第一部分海藻酸支架—MSC復(fù)合物的構(gòu)建及其生物相容性的研究

7、 一、材料與方法: 1.MSC的分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增及檢測(cè) Wistar大鼠斷頸處死后無(wú)菌條件下取出股骨及脛骨，用含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔，離心后棄去上清并用DMEM重懸接種培養(yǎng)，按1:2傳代，傳至3～4代細(xì)胞備用。另取第3代MSC進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)鑒定和誘導(dǎo)成骨鑒定。 2.海藻酸三維支架的構(gòu)建 吸取3％的海藻酸鈉水溶液700μl滴入24孔塑料培養(yǎng)板的孔中，在孔內(nèi)形成約1mm厚度的圓盤，再滴

8、入0.1％的CaCl22ml于圓盤上，靜置40min。待凝膠形成后棄去CaCl2，改用2mlα—2MEM浸泡，放入4℃冰箱，每24h更換α2MEM一次，72h后用于細(xì)胞培養(yǎng)。 3.MSC與海藻酸支架復(fù)合物的構(gòu)建 將海藻酸三維立體支架放置于24孔板內(nèi)，將含有1×106細(xì)胞的MSC懸液約200μl滴注于支架上并放置于培養(yǎng)箱內(nèi)。 4.MSC與海藻酸支架復(fù)合物相容性的檢測(cè) 4.1普通顯微鏡觀察定期于倒置相差顯微鏡

9、下觀察MSC在支架上的黏附及增殖情況。 4.2掃描電鏡觀察細(xì)胞與支架復(fù)合物共同培養(yǎng)7天后于冰凍干燥箱內(nèi)干燥24h，表面噴金后于Philps掃描電鏡下觀察。 4.3MTT實(shí)驗(yàn)取第一代(P1)、P3、P5的MSC懸液，以1×104個(gè)/孔接種在放置于96孔培養(yǎng)板中的海藻酸三維立體培養(yǎng)支架上，加200μl細(xì)胞培養(yǎng)基，37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)第1、3、5、7、9、11、13、15天，各代次分別隨機(jī)抽取3孔，進(jìn)行MTT測(cè)定。

10、 4.4組織學(xué)檢測(cè)海藻酸支架和MSC復(fù)合物體外培養(yǎng)3天后4％多聚甲醛固定24h，常規(guī)酒精逐級(jí)脫水，石蠟包埋切片，行HE染色后觀察。 二、結(jié)論: 1.海藻酸三維支架具有適合作為細(xì)胞載體的特性和結(jié)構(gòu)。 2.MSC與海藻酸三維支架具有良好的相容性，MSC在海藻酸三維支架上能良好地附著并生長(zhǎng)。 第二部分利用海藻酸支架—MSC復(fù)合物體外構(gòu)建人工肝組織的研究 一、材料與方法: 1.海藻酸支架—

11、MSC復(fù)合物的構(gòu)建 2.誘導(dǎo)液的配置及誘導(dǎo)方法 60％DMEM，40％MCDB—201，1mg/ml牛血清蛋白(BSA)，10-8M地塞米松，10-4M維生素C，2％胎牛血清，10ng/mlEGF，20ng/mlHGF，10ng/mlFGF—4。將MSC按上述方法種植于支架并放置于24孔板內(nèi)24h后加入誘導(dǎo)液，量約1ml/孔，每天換液，并于普通顯微鏡下觀察細(xì)胞情況。 3.被誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)肝細(xì)胞特異性功能的檢測(cè)

12、 3.1培養(yǎng)液尿素(UREA)、白蛋白(ALB)測(cè)定于誘導(dǎo)后的第7、14、21、28天將誘導(dǎo)液更換為不含胎牛血清的誘導(dǎo)液培養(yǎng)24h后吸取上清按照尿素氮檢測(cè)試劑盒和白蛋白液體試劑盒操作。 3.2RT—PCR法檢測(cè)被誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)肝細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)(AFP、ALB、Cox32、CYP7A1) 在誘導(dǎo)后的第14和28天時(shí)提取細(xì)胞總RNA，檢測(cè)甲AFP和ALB基因的表達(dá)情況，并于第28天檢測(cè)Cox32和CYP7A1的表達(dá)。

13、 3.3免疫熒光法檢測(cè)CK-18的表達(dá)誘導(dǎo)后的第28天取出支架與細(xì)胞復(fù)合物行冰凍切片，用羊抗鼠CK-18抗體和兔抗羊IgG(H+L)/TRITC孵育后于熒光顯微鏡下觀察。 3.4CK-18陽(yáng)性率的檢測(cè)將完成CK-18染色的切片共10張，用Hoechst3328將切片上的所有細(xì)胞染核后檢測(cè)CK-18的陽(yáng)性表達(dá)率。 3.5糖原染色檢測(cè)被誘導(dǎo)細(xì)胞糖原儲(chǔ)存功能另取部分切片，AAF液固定后PAS染色檢測(cè)支架上細(xì)胞糖原儲(chǔ)存功能。

14、 二、結(jié)論:以EGF、HGF、FGF—4等細(xì)胞因子混合液為誘導(dǎo)因子，能在海藻酸三維支架上成功誘導(dǎo)MSC向肝細(xì)胞分化；海藻酸三維支架和MSC在體外可望成為肝組織工程理想的種子細(xì)胞和細(xì)胞載體。 第三部分海藻酸支架—MSC復(fù)合物治療大鼠肝功能不全的研究 一、材料與方法: 1.MSC的培養(yǎng)、CM—DIL標(biāo)記MSC的培養(yǎng)見第一部分。在MSC懸液內(nèi)加入CM—DIL液約5μl，37℃孵育10min，4℃冰箱放置20min

15、，PBS洗3遍后待用。 2.MSC與海藻酸三維支架復(fù)合物的構(gòu)建 3.實(shí)驗(yàn)分組及處理實(shí)驗(yàn)分獨(dú)立的70％肝切除大鼠組(A組)和肝硬化大鼠組(B組)，每組20只大鼠，雌雄各半。A、B兩組各細(xì)分實(shí)驗(yàn)組(A1和B1)和對(duì)照組(A2和B2)。A1和B1組給予MSC—海藻酸支架復(fù)合物，A2和B2組則單獨(dú)給予海藻酸支架。 4.熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記了CM—DIL的MSC和支架細(xì)胞復(fù)合物將種植在24孔板內(nèi)的支架細(xì)胞復(fù)合物放置于熒光顯

16、微鏡下在波長(zhǎng)為540-650nm范圍內(nèi)觀察。 5.冰凍切片觀察支架細(xì)胞復(fù)合物體內(nèi)應(yīng)用后情況手術(shù)后的第4周處死實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠并取出支架細(xì)胞復(fù)合物，行冰凍切片并固定后置于熒光顯微鏡下觀察，并用Hoechst染核。 6.免疫組化法檢測(cè)復(fù)合物內(nèi)白蛋白的表達(dá)取部分切片用羊抗鼠ALB溶液及驢抗羊液體孵化，DAB顯色法檢測(cè)。 二、結(jié)論： 　1.CM—Dil可以做為細(xì)胞體內(nèi)示蹤的穩(wěn)定的染料。 　 2.在70％肝切除大鼠