乙型肝炎病毒核苷(酸)類似物耐藥的臨床及生物信息學(xué)研究.pdf

1、研究背景：
　　 慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)威脅全球人類健康,全球1/3以上的慢性乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染者在中國,每年有約50萬患者因終末期肝病死亡。近年隨著核苷(酸)類似物(nucleos(t)ide analogues,NAs)在臨床慢性乙肝抗病毒治療中的普遍應(yīng)用,長期治療發(fā)生的耐藥問題成為NAs臨床治療失敗的最重要的因素之一。在臨床實(shí)踐中,HBV耐

2、藥及耐藥進(jìn)化的復(fù)雜性已成為影響臨床抗病毒治療療效的重要因素。
　　 臨床上預(yù)防耐藥的重要策略之一是初治優(yōu)先選擇高效、高基因屏障和低耐藥率的藥物。但是在我國初治選用拉米夫定或阿德福韋酯的CHB人群數(shù)量巨大,已有相當(dāng)比例的病人發(fā)生了拉米夫定(LAM)、阿德福韋酯(ADV)基因型耐藥。臨床實(shí)踐中耐藥后病人的挽救治療先后經(jīng)歷了NAs單藥序貫治療和聯(lián)合補(bǔ)救治療模式的探索。目前達(dá)成共識的挽救治療方案并不能夠解決所有已出現(xiàn)耐藥患者的后續(xù)抗病毒

3、治療問題。加之在我國替諾福韋(TDF)尚未上市,國內(nèi)經(jīng)濟(jì)發(fā)展存在地域不平衡性,挽救治療的成本和效益之間的關(guān)系是必須要考慮的問題。因此探索有效的挽救治療策略是當(dāng)前應(yīng)對耐藥比較緊迫和重要的任務(wù)。
　　 恩替卡韋(ETV)與ADV沒有共同耐藥通路,故ETV聯(lián)合ADV可能是既往核苷類似物治療失敗病例有價值的補(bǔ)救治療方案之一。因此觀察ETV聯(lián)合ADV短期和長期治療的有效性、安全性和評估影響療效的因素,在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化核苷類似物治療失敗

4、病人的挽救治療方案,提高臨床耐藥管理水平。
　　 目的:
　　 1、通過臨床回顧性研究,評價ETV聯(lián)合ADV作為一種挽救治療方案,既往NAs治療失敗的慢乙肝患者治療的療效和安全性。
　　 2、通過生物信息學(xué)研究,了解可能影響病毒復(fù)制的變異及模式、rtM204位點(diǎn)變異和HBV基因型的關(guān)系。
　　 方法:
　　 第一部分是既往NAs治療失敗的慢乙肝患者經(jīng)ETV聯(lián)合ADV挽救治療臨床回顧性研究,研究病例

5、45例,分析既往NAs治療失敗的臨床特征(基因型耐藥類別、既往首次不同NAs藥物治療和首次不同挽救治療方案24周病毒學(xué)應(yīng)答)。評價聯(lián)合治療24周和52周療效,單因素分析可能影響應(yīng)答的因素。
　　 第二部分是HBV RT區(qū)rtM204位點(diǎn)耐藥相關(guān)變異的生物信息研究,從GenBank HBV數(shù)據(jù)庫中下載HBV全基因序列,以編碼Y(M/I/V)DD的2949株HBV全基因序列為研究對象,在基因型和基因亞型分型的基礎(chǔ)上,研究可能影響病毒

6、復(fù)制的“熱點(diǎn)”變異與基因型的關(guān)系；研究RT區(qū)rtM204位點(diǎn)Y(Ⅰ/Ⅴ)DD差異的基因型選擇性差異:初步探討非RT區(qū)可能影響病毒復(fù)制活性的“熱點(diǎn)”變異與RT區(qū)rtM204位點(diǎn)Y(Ⅰ/Ⅴ)DD變異可能的關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 1、33例經(jīng)NAs初治失敗后改用干擾素,或者換用ADV或ETV單藥序貫治療,或LAM聯(lián)合ADV等挽救治療方案的患者24周獲得病毒學(xué)應(yīng)答(VR)率僅為24.2％(8例),而12例初治失敗后用ETV聯(lián)

7、合ADV方案患者24周獲得VR率為83.3％(10例),因此對于NAs初治失敗患者,ETV聯(lián)合ADV挽救治療方案24周VR率顯著高于其他補(bǔ)救方案(x2=11.785,P=0.002)。
　　 2、45例既往NAs治療失敗(包括初治失敗和復(fù)治失敗)患者,ETV聯(lián)合ADV治療的患者基線基因型耐藥檢出率為48.9％(22例),含rtM204I變異模式者占54.5％(12例),其中rtM204I單點(diǎn)模式11例,rtM204I聯(lián)合rtM1

8、80M變異模式1例。非rtM204I變異模式者占45.5％(10例),rtM204V-nL180M(1例)、rtM204V-rtL180M-rtS202G(1例)、rtM204V-rtL180M-rt184L(1例)、rtA181V(2例)、rtA181T(4例)和rtA181T-rtN136T(1例),共6種模式。rtM204I模式既往NAs治療時間中位數(shù)52月(16—138個月),非204I模式既往NAs治療時間中位數(shù)48月(12-

9、84個月)
　　 3、ETV聯(lián)合ADV治療24周VR、生化應(yīng)答(BR)和聯(lián)合應(yīng)答(CR)率分別為66.7％(30例)、77.82％(32例)和57.8％(26例)。52周VR、BR和CR率分別是76.2％(32例)、78.6％(33例)和61.9％(26例)。與基線相比,治療24周、52周時的VR率(Z值為-4.796和-5.099；P值為0.000和0.000)、BR率(Z值為-3.606和-3.742；P值為0.033和0.

10、021)和CR率(Z值為-4.472和-4.690；P值為0.000和0.000)均有顯著性提高。
　　 4、單因素分析顯示rtM204I耐藥模式療效優(yōu)于非rtM204I模式,兩種模式基線HBV DNA差異(5.19±1.40 Lgcopies/mLvs5.79±1.77 Lgcopies/mL,F=2.338,P=0.142)無統(tǒng)計學(xué)差異?；€未檢出耐藥組、rtM204I耐藥模式組和非rtM204I模式組三組間CR率的差異在治

11、療24周(x2=7.657,P=0.022)和52周(x2=6.216,P=0.048)時均有統(tǒng)計學(xué)意義。rtM204I耐藥模式組和非rtM204I模式組兩組間CR率在治療24周(75％vs20％,Z=-2.023,P=0.030)、52周(81％vs30％,Z=-2.339,P=0.043)均有統(tǒng)計學(xué)意義。肝硬化組比非肝硬化組BR率低(24周BR率17.1％vs82.9％,x2=4.546,P=0.048；48周BR率23.8％vs7

12、6.2％,x2=6.364,P=0.023)；基線HBV DNA水平為3-6 Lgcopies/mL的患者與HBV DNA水平大于6 Lgcopies/mL的患者相比,前者48周VR率顯著高于后者(85.2％vs40％,Z=-4.796,P=0.037)。
　　 5、HBV基因缺失變異:對來自GenBank數(shù)據(jù)庫的2849株全基因序列分析,其中A-D四種基因型有2531株,A型391株(13.7％)、B型542株(19％)、C型

13、1138株(39.9％)和D型391株(16.1％)。缺失變異主要集中在PreS1、PreS2和C基因區(qū)段,其中發(fā)生PreS1和/或PreS2缺失變異共182株,PreS缺失在A-D四種基因型中的比例分別為16.5％、5.5％、64％和14％,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(x2=36.995,P=0.001),C基因型最高,B型最低。74.2％的PreS缺失變異(135株)同時存在前C區(qū)(PC)和C基因啟動子(BCP)變異(G1896A、G1899

14、A和A1762T/G1764A變異),兩者間關(guān)系(x2=31.376,P=0.000)有統(tǒng)計學(xué)意義,與C基因型高度相關(guān)。
　　 6、HBV基因起始密碼子變異:451株(15.8％)有P、PreS1、PreS2、S、PreC或C基因起始密碼子變異,其中PreS1、PreS2、PreC起始密碼子變異440株,在基因型A-D(n=415株)中分布(x2=62.189,P=0.000)有統(tǒng)計學(xué)意義。PreS1起始密碼子變異平均秩次(Me

15、an Rank)由高到低:C型1308.36,A型1242.87,B型1236.18,D型1216.00；PreS2起始密碼子變異平均秩次由高到低:C型1305.97,A型1262.25,B型1242.95,D型1197.52；PreS變異平均秩次由高到低:C型1345.88,A型1241.12,B型1215.08,D型1149.52。PreC起始密碼子變異平均秩次由高到低:A型1346.78,D型1272.02,B型1247.51,C

16、型1244.62。
　　 7、HBV基因PC/BCP變異:2849株全基因序列中1543株(54.2％)有PC(G1896A,G1899A)和或BCP(A1762T/G1764A)區(qū)變異及聯(lián)合變異,變異在A-D基因型間的分布(x2=156.841,P=0.000)有統(tǒng)計學(xué)意義。7種變異模式①G1896A；②G1899A;③G1896A+G1899A；④A1762T/G1764A；⑤A1762T/G1764A+G1896A；⑥A1

17、7621/G1764A+G1899A和⑦A1762T/G1764A+G1896A+G1899A在A-H基因型間的分布(x2=682.894,P=0.000)有統(tǒng)計學(xué)意義。發(fā)生PC變異平均秩次由高到低:D型1495.17,B型1441.91,C型1143.84,A型1108.08；發(fā)生BCP變異平均秩次由高到低:C型1444.25,A型1244.74,B型1108.61,D型1028.53；發(fā)生PC-BCP聯(lián)合變異平均秩次由高到低:C型1

18、335.49,B型1266.62,D型11220.56,A型1116.34。B和D基因型PC變異的差異在于①G1896A(22.5％vs16.5％,Z=-2.371,P=0.021)和③G1896A+G1899A模式(5.9％vs14.3％,Z=-4.482,P=0.000)有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 8、HBV基因YMDD變異:Y(Ⅰ/Ⅴ)DD毒株共217株,YIDD120株,YVDD97株,YIDD基因型分布為:A(2株)、B(B

19、219株)、C(80株、C11株、C278株、C51株)、D(17株)、E(1株)、G(1株)；YVDD基因型分布:A(17株)、B(B222株)、C(c13株；C248株)、D(3株)、G(3株)、H(1株)。兩種變異在基因型A～D(x2=25.558,P=0.000)、A～C(x2=17.814,P=0.000)及A和B(Z=-2.683,P=0.007)間的分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；Y(Ⅰ/Ⅴ)DD在基因型B～D(x2

20、=8.430,P=0.015)及C和D分布差異(Z=-2.073,P=0.038)有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Y(Ⅰ/Ⅴ)DD在基因型B和C分布差異(Z=-1.660,P=0.097)無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。五種主要變異模式(單純rtM204Ⅰ/Ⅴ、聯(lián)合一個補(bǔ)償位點(diǎn)rtL180M或rtL80Ⅰ/Ⅴ、聯(lián)合兩個補(bǔ)償位點(diǎn)rtL180M-rtV173L或rtL180M—rtL80Ⅰ/Ⅴ)在Y(Ⅰ/Ⅴ)DD中構(gòu)成(x2=96.293,P=

21、0.000)有統(tǒng)計學(xué)意義。YIDD主要變異模式在基因型A～D分布差異(x2=0.832,P=0.871)及B2和C2型分布差異(x2=1.928,P=0.749)無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；YVDD主要變異模式在基因型A～D分布差異(x2=16.447,P=0.000)有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),其中rtM204V-rtL180M和rtM204V-rtL180M-rtV173L模式在B2～C2亞型分布差異(x3=9.531,P=0.

22、002)有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。發(fā)生YVDD時,B2亞型rtM204V-rtL180M模式為主,rtM204V-rtL180M-rtV173L具有C2亞型高度選擇性。
　　 9、YMDD變異與PC/BCP變異的相關(guān)性:rtM204Ⅰ/Ⅴ毒株共217株,與PC/BCP變異共存的序列165株,聯(lián)合變異率為76％。YMDD變異株比野生株易合并PC/BCP變異(10.75％vs4.7％,x2=45.283,P=0.000)。在PC

23、/BCP變異的背景下,YMDD變異以YIDD多見(61.8％vs38.2％,x2=11.836,P=0.001)。rtM204Ⅰ/Ⅴ變異與PC/BCP變異(x2=11.836,P=0.001)及與PC/BCP七種變異模式(x2=19.186,P=0.001)差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與YMDD變異共存的不同PC/BCP變異模式的相對危險度的高低依次是⑤A1762T/G1764A+G1896A(P=0.000,OR:4.37,95％CI:2.85

24、1-6.697；④A1762T/G1764A(P=0.000,OR:3.102,95％CI:2.140-4.498)及③G1896A-G1899A(P=0.002,OR:2.790,95％CI:1.471-5.292);⑦A1762T/G1764A-G1896AA-1899G(P=0.048,OR:2.32,95％CI:1.008-5.339)。不同的變異模式對YI/VDD選擇性危險度有區(qū)別。僅對YIDD有影響而對YVDD無影響的變異模

25、式有③G1896A+G1899A(P=0.000,OR=8.213)、⑥A1762T/G1764A+G1899A(P=0.000,OR=6.699)和⑦A1762T/G1764A+G1896A+G1899A(P=0.000,OR:6.714)。
　　 結(jié)論：
　　 1、多種NAs治療背景下,RT區(qū)rtM204I變異模式占優(yōu)勢,提示rtM204I具有較好適應(yīng)性。
　　 2、ETV聯(lián)合ADV對既往NAs治療失敗的CH

26、B患者是一種安全、有效的補(bǔ)救治療方案。rtM204I模式聯(lián)合應(yīng)答(療效)比非rtM204I模式好。治療前HBVDNA水平低的非肝硬化患者療效更好。
　　 3、HBV不同部位變異具有基因型選擇性。
　　 (1)PreS缺失變異多發(fā)生于C基因型。
　　 (2)A型最易發(fā)生PreC起始密碼子變異,而C基因型易發(fā)生PreS1和PreS2起始密碼子變異,可能起始密碼子變異具有基因型選擇性。
　　 (3)PC/BCP

27、變異模式具有基因型選擇性。PC變異發(fā)生率由高到低為D>B>C>A；BCP變異發(fā)生率由高到低為C>A>B>D；PC/BCP聯(lián)合變異發(fā)生率為C>B>D>A。C基因型變異程度在所有基因型中最復(fù)雜。
　　 4、Y(Ⅰ/Ⅴ)DD的差異不僅有補(bǔ)償模式的差異,并且具有基因型選擇性,A型易發(fā)生YVDD變異,D型易發(fā)生YIDD變異,C型YIDD比B型多見。rtM204V-rtL180M-rtV173L,變異模式具有高度C2基因亞型選擇性。