兔原代左心房肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷及其防護(hù)的研究.pdf

1、目的：氧化應(yīng)激在過去的研究中已被證實(shí)是涉及人類多種疾病的發(fā)生發(fā)展的一個重要因素。大量的研究顯示氧化應(yīng)激產(chǎn)物如活性氧能夠影響心房顫動時心房的電重構(gòu)及結(jié)構(gòu)重構(gòu)；而房顫時心房肌的氧化應(yīng)激產(chǎn)物增加,以及線粒體DNA存在氧化損傷也表明了房顫時心房存在氧化應(yīng)激.但目前的研究并不能明確氧化應(yīng)激是房顫的始動機(jī)制還是一種繼發(fā)反應(yīng),且缺乏有針對性的抗氧化作用的藥物。本研究利用過氧化氫構(gòu)建原代培養(yǎng)兔心房肌細(xì)胞氧化損傷模型,并用在氧化還原反應(yīng)中起關(guān)鍵作用的煙酰

2、胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶抑制劑-夾竹桃麻素和回心草單體成分胡椒堿干預(yù).通過分析氧化損傷的關(guān)鍵因素如細(xì)胞內(nèi)過氧化物、氧化還原酶類含量等,探討氧化應(yīng)激與房顫的關(guān)系及作用機(jī)制。
　　 方法：⑴利用低濃度過氧化氫(H2O2)構(gòu)建原代培養(yǎng)兔心房肌細(xì)胞,制作氧化應(yīng)激損傷模型,并用夾竹桃麻素和回心草單體成分胡椒堿干預(yù)。⑵觀察上述條件下原代培

3、養(yǎng)的心房肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化,并用MTT法檢測細(xì)胞活力,流式細(xì)胞儀檢測心房細(xì)胞凋亡率。⑶黃嘌呤氧化酶法檢測超氧化物歧化酶活力(superoxide dismutase,SOD)、硫代巴比妥酸比色法檢測丙二醛(malondialdehyd,MDA)含量及比色法檢測谷胱甘肽(glutathione hormone,GSH)；鈣離子熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度。⑷Real time-PCR對線粒體mRNA進(jìn)行定量分析；Western Blotti

4、ng蛋白質(zhì)凝膠電泳及條帶分析檢測NADPH氧化酶亞基p22phox表達(dá)。
　　 結(jié)果：①與對照組比較,原代心房肌的細(xì)胞活力H2O2組明顯低于對照組(P<0.05),H2O2組的SOD活力和GSH含量均下降(P<0.05),而MDA的含量和鈣離子濃度均增加(P<0.05)；NADPH氧化酶亞基p22phox mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.05)。原代心房肌細(xì)胞的凋亡率明顯增高(P<0.05)。②胡椒堿組的細(xì)胞活力顯著高于H2O2組

5、(P<0.05)；H2O2組和胡椒堿組的SOD活力和GSH含量均下降(P<0.05),但在胡椒堿組明顯高于H2O2組(P<0.05)。H2O2組和胡椒堿組的MDA和鈣離子濃度均增加(P<0.05)；但胡椒堿組的上述指標(biāo)均低于H2O2組(P<0.05)。H2O2組與對照組相比SOD和GSH明顯減少(P<0.05),MDA增多(P<0.05)；與H2O2組比較,胡椒堿組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05).心房肌細(xì)胞線粒體mRNA的表達(dá)在胡

6、椒堿組顯著低于H2O2組(P<0.05)。③夾竹桃麻素組細(xì)胞活力明顯高于H2O2組(P<0.05)。與H2O2組相比,夾竹桃麻素組SOD和GSH增加(P<0.05),MDA顯著減少(P<0.05)。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度在H2O2組和夾竹桃麻素組均較對照組明顯增多(P<0.05),夾竹桃麻素組明顯低于H2O2組(P<0.05)。與對照組比較,夾竹桃麻素組和H2O2組的NADPH氧化酶亞基p22phox表達(dá)均顯著升高(P<0.05),但夾竹桃麻

7、素組較H2O2組表達(dá)降低(P<0.05)。與H2O2組比較,夾竹桃麻素組細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05),同時線粒體mRNA的表達(dá)在夾竹桃麻素組明顯低于H2O2組(P<0.05)。
　　 結(jié)論：⑴研究顯示H2O2的氧化損傷對原代心房肌細(xì)胞的氧自由基的產(chǎn)生、抗氧化酶的活性、多不飽和脂肪酸的脂質(zhì)過氧化以及線粒體氧化磷酸化都有很明顯的影響。發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激損傷使得心房肌的NADPH氧化酶亞基p22phox的表達(dá)增加,對氧化應(yīng)激有保護(hù)作

8、用的SOD和GSH的活力下降,反映細(xì)胞損傷的MDA含量增加,并造成線粒體損傷,細(xì)胞內(nèi)鈣含量增加。⑵回心草的提取物胡椒堿能夠從氧自由基的產(chǎn)生清除等環(huán)節(jié)減少活性氧自由基在細(xì)胞內(nèi)的堆積,減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)對細(xì)胞的損傷,保護(hù)線粒體氧化磷酸化的功能,減輕線粒體的氧化損傷.胡椒堿還能夠減輕細(xì)胞內(nèi)鈣超載,減少氧化損傷對細(xì)胞活力的影響,其作用環(huán)節(jié)很可能是通過抑制NADPH氧化酶。此外胡椒堿能夠通過減少氧自由基的堆積從而減輕由于氧化損傷引起的細(xì)胞凋亡。因

9、此胡椒堿能夠?qū)υ姆考〖?xì)胞的氧化損傷起到一定保護(hù)作用。⑶夾竹桃麻素是特異的NADPH氧化酶抑制劑,能通過抑制NADPH氧化酶亞基p22phox的表達(dá),減輕氧化應(yīng)激損傷。夾竹桃麻素在氧化損傷時能夠從氧自由基的產(chǎn)生清除等環(huán)節(jié)減少活性氧自由基的產(chǎn)生,調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性,減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)對細(xì)胞的損傷,保護(hù)線粒體氧化磷酸化的功能,減輕線粒體的氧化損傷。同時夾竹桃麻素還能夠減少氧化應(yīng)激所致的細(xì)胞凋亡,其機(jī)制很可能是通過抑制NADPH氧化酶激活,