乙醛脫氫酶2抑制氧化應(yīng)激導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡及其分子機(jī)制.pdf

1、缺血再灌注所導(dǎo)致的心肌損傷是多種原因共同作用的結(jié)果，其中比較明確的即是再灌注過(guò)程中爆發(fā)性產(chǎn)生的活性氧(ROS)。如何降低再灌注過(guò)程中產(chǎn)生的大量ROS對(duì)減輕心肌損傷，保護(hù)心功能至關(guān)重要。乙醛脫氫酶2(aldehydedehydrogenase2，ALDH2)一種線粒體蛋白，屬于乙醛脫氫酶家族，以前的研究認(rèn)為其主要功能是氧化酒精的代謝物乙醛為乙酸。近年的研究發(fā)現(xiàn)，ALDH2有明顯的心臟保護(hù)作用。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ALDH2活性被抑制后，抗霉

2、素A處理的心肌細(xì)胞，凋亡比例顯著增加。缺血缺氧所致心肌細(xì)胞的凋亡，存在多種分子機(jī)制，ALDH2作為一線粒體蛋白通過(guò)降解缺血缺氧過(guò)程中產(chǎn)生的4-羥壬烯醛(4-HNE)，降低轉(zhuǎn)錄因子p53的表達(dá)，減少缺血導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡。
　　第一部分抑制乙醛脫氫酶2活性增加抗霉素A誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡
　　目的：檢測(cè)乙醛脫氫酶2(ALDH2)被daidzin抑制時(shí)，抗霉素A(antimycin A)誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的變化，驗(yàn)證乙醛脫氫酶2

3、(ALDH2)在此過(guò)程中所起的作用。
　　方法：在確定daidzin的最佳抑制濃度后，比較新生大鼠心肌細(xì)胞在daidzin預(yù)處理24小時(shí)后，抗霉素A對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響以及MAPK信號(hào)通路的變化。酶活性檢測(cè)采用乙醛代謝法、ROS的檢測(cè)用C400測(cè)定，凋亡的測(cè)定通過(guò)Hoechest33324和免疫熒光標(biāo)記的流式細(xì)胞儀檢測(cè)，MAPK信號(hào)通路酶(ERK，JNK，P38)的磷酸化改變用western blot方法檢測(cè)。
　　結(jié)果：D

4、aidzin在濃度為60μM的時(shí)候，可將ALDH2活性降低50％，而對(duì)細(xì)胞的凋亡無(wú)明顯影響。以此濃度daidzin處理細(xì)胞顯著增強(qiáng)抗霉素A誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Hochest法顯示凋亡細(xì)胞比例從33.5±4.4％增加到56.5±6.4％(p<0.05)，和FACS法顯示凋亡細(xì)胞比例從57.9±1.9％增加大74.0±11.9％(p<0.05)。Daidzin增加抗霉素A活化的MAPK信號(hào)通路酶，表現(xiàn)在三種激酶的磷酸化蛋白顯著增加。
　　

5、結(jié)論：Daidzin抑制ALDH2活性，增加抗霉素A誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。在此凋亡過(guò)程中MAPK激酶通路被激活。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)調(diào)整ALDH2活性或蛋白表達(dá)影響氧化應(yīng)激導(dǎo)致的心肌細(xì)胞凋亡。
　　第二部分乙醛脫氫酶2抗心肌細(xì)胞凋亡的機(jī)制
　　目的：確定ALDH2拮抗缺血缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑
　　方法：免疫組化方法檢測(cè)野生型及ALDH2基因敲除小鼠心梗區(qū)域4-羥壬烯醛(4-HNE)及p53表達(dá)情況。以langen

6、dorff模型，研究小鼠心臟體外灌注4-HNE或缺血再灌注后，心肌細(xì)胞受損及p53表達(dá)情況。心肌細(xì)胞在p53抑制劑pifithrin-α存在與否的情況下，4-HNE誘導(dǎo)的凋亡細(xì)胞比例。Western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞在ALDH2轉(zhuǎn)染后，缺氧對(duì)p53總蛋白及磷酸化p53的影響。同樣以westernblot法檢測(cè)4-HNE處理心肌細(xì)胞后磷酸化ERK及JNK的表達(dá)情況。ERK及JNK抑制劑預(yù)處理新生大鼠心肌細(xì)胞后，4-HNE刺激細(xì)胞p53

7、表達(dá)情況。結(jié)果：心肌切片染色顯示，ALDH2敲除小鼠，心梗區(qū)域4.HNE及p53表達(dá)明顯增加。野生型小鼠轉(zhuǎn)染ALDH2基因后，心梗區(qū)域4-HNE及p53表達(dá)顯著降低。小鼠心臟灌注4-HNE后，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞損傷和凋亡，p53表達(dá)也顯著增加。4-HNE心臟灌注對(duì)小鼠的心肌損傷與缺血再灌注對(duì)小鼠心肌損傷相似。體外實(shí)驗(yàn)中，p53抑制劑Pft顯著抑制4-HNE誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。心肌細(xì)胞在轉(zhuǎn)染ALDH2后，拮抗缺氧誘導(dǎo)的p53高表達(dá)。4-HNE