高變區(qū)1抑制丙型肝炎病毒包膜E2蛋白免疫原性的機(jī)制研究.pdf

1、丙型肝炎病毒（Hepatitis C Virus, HCV)為單股正鏈RNA 病毒，黃病毒科成員，是經(jīng)血液傳播而引起急、慢性肝炎的主要致病因子之一。目前全球約有1.7億人感染HCV，每年新發(fā)感染者約300萬例。HCV 慢性感染率高達(dá)70％以上，HCV慢性感染在發(fā)達(dá)國家是導(dǎo)致肝硬化、肝細(xì)胞癌等終末期肝病的主要原因。HCV 感染還與多種肝外疾病，如淋巴瘤、混合性冷球蛋白血癥、腎小球腎炎、遲發(fā)性皮膚卟啉癥、糖尿病等密切相關(guān)。目前全球范圍內(nèi)經(jīng)血

2、液以及血制品途徑感染的丙型肝炎病例與上世紀(jì)九十年代以前相比有大幅下降，但在發(fā)展中國家血液和血制品仍然是傳播HCV的重要途徑。此外，每年散發(fā)性以及傳播途徑不明的丙型肝炎新發(fā)病例在全球范圍內(nèi)仍高居不下?？刂艸CV感染的關(guān)鍵措施還依賴于開發(fā)出有效的疫苗。從1989年HCV基因組被克隆以來，丙型肝炎疫苗的研究在歐美和日本等發(fā)達(dá)國家一直是研究熱點(diǎn)，但迄今未有有效的疫苗問世。HCV 包膜E2蛋白是介導(dǎo)HCV細(xì)胞侵入的關(guān)鍵蛋白，該蛋白氨基末端的27個(gè)

3、氨基酸是第一個(gè)鑒定出的含中和抗體表位的區(qū)域，因其序列高變而被稱為高變區(qū)1（hypervariable Region 1，HVR1），HVRl的高度變異曾被認(rèn)為是遏制丙肝疫苗發(fā)展的瓶頸問題。然而，近幾年來基于感染性假HCV 顆粒（HCVpp）以及細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的HCV（HCVcc）的中和試驗(yàn)表明，HVRl并不是唯一的中和抗體表位所在區(qū)域，在HCV包膜E2蛋白中還存在保守的空間構(gòu)象和線性中和抗體表位。本實(shí)驗(yàn)室之前研究HVR1免疫特性時(shí)發(fā)現(xiàn)：H

4、VR1具有強(qiáng)免疫原性，可高效誘導(dǎo)中和抗體，同時(shí)，HVR1非常顯著地抑制HCV 包膜E2蛋白中保守抗原表位的抗體應(yīng)答。本研究中，我們進(jìn)一步從免疫原性和蛋白結(jié)構(gòu)等方面分析HVR1免疫誘餌作用的可能機(jī)制，并鑒定出其中的關(guān)鍵氨基酸序列，為認(rèn)識(shí)HCV免疫逃避以及HCV細(xì)胞侵入機(jī)制提供全新信息，為HCV 疫苗的研究提出全新思路。
　　 一、HVR1中抑制E2蛋白免疫原性的關(guān)鍵肽段的鑒定
　　 方法：1、質(zhì)粒構(gòu)建：以1a基因型H77株

5、HCV 包膜蛋白基因?yàn)樵?，?gòu)建HVR1中部分氨基酸殘基缺失的各種分泌型E2蛋白表達(dá)質(zhì)粒，包括缺失整個(gè)HVR1（77Δ）、缺失HVR1第1至12 位氨基酸殘基（77Δ1-12）、缺失第13 至27 位氨基酸殘基（77Δ13-27）、缺失第16 至24 位氨基酸殘基（77Δ16-24）以及含完整HVR1（77）的5種質(zhì)粒。2、E2蛋白表達(dá)檢測(cè)：用ELISA、Western blot和免疫熒光檢測(cè)各種E2蛋白的表達(dá)和分泌。3、DNA免疫：將

6、上述質(zhì)粒肌肉注射免疫Balb/C小鼠。4、抗體檢測(cè)：用ELISA和免疫熒光檢測(cè)小鼠血清中的E2Δ抗體、HVR1抗體以及三個(gè)已知B細(xì)胞表位（412、522、432）的反應(yīng)。
　　 結(jié)果：缺失HVR1或其中的部分殘基對(duì)E2蛋白的表達(dá)、分泌及構(gòu)象無明顯影響。含有HVR1或HVR1第16-24 位氨基酸的質(zhì)?？擅庖咝∈笳T導(dǎo)產(chǎn)生HVR1抗體，同時(shí)抑制E2蛋白中其他表位的抗體應(yīng)答，而去除第16-24 位氨基酸即可消除這種抑制作用。結(jié)論：高變

7、區(qū)1中的16-24 位氨基酸為抑制E2蛋白免疫原性的關(guān)鍵肽段，而該肽段是我們前期鑒定出的H77株HVR1中的唯一B細(xì)胞表位。
　　 二、HVR1抑制HCV 包膜E2蛋白免疫原性的機(jī)制研究
　　 方法：1、構(gòu)建質(zhì)粒：將HVR1移位到E2蛋白羧基末端（77Δ-HC）、在E2 羧基末端增加HVR1肽段（77-HC）；將HVR1與HBsAg 串聯(lián)（S-HN）；將HVR1替換為其他抗原表位HA表位（77HA）。2、將各重組質(zhì)粒免疫

8、小鼠。3、檢測(cè)小鼠產(chǎn)生的HVR1抗體、HA抗體、E2抗體以及HBsAg抗體，分析各種抗體水平之間的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：1、HVR1的定位不影響其對(duì)E2免疫原性的抑制作用。2、HVR1可抑制HBsAg誘導(dǎo)的抗體應(yīng)答。3、HA表位也能抑制E2的免疫原性。
　　 結(jié)論：HVR1是免疫優(yōu)勢(shì)表位，可抑制HBsAg的免疫原性；E2蛋白其他區(qū)域的免疫原性易受HVR1以及HA表位的影響，導(dǎo)致誘導(dǎo)抗體的能力降低。
　　 三、免疫

9、血清對(duì)病毒的中和作用研究
　　 方法：1、將幾種代表性質(zhì)粒（77、77Δ、77Δ13-27）用肌肉注射聯(lián)合電脈沖免疫新西蘭大白兔。2、檢測(cè)兔血清抗體。3、純化兔血清中的IgG，分析IgG對(duì)HCVpp 以及HCVcc的中和活性。
　　 結(jié)果：1、質(zhì)粒77能誘導(dǎo) E2抗體，但其中針對(duì) HVR1的抗體占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；以E2Δ作為抗原檢測(cè)兔血清，則質(zhì)粒77Δ、77Δ13-27 誘導(dǎo)的抗體顯著強(qiáng)于77；2、用不同基因型 E1E2為抗原

10、檢測(cè)兔血清抗體，表明缺失 HVR1能顯著提高 E2蛋白誘導(dǎo)交叉中和抗體；3、HCVpp中和試驗(yàn)表明，77免疫血清的中和作用主要依賴于 HVR1抗體，缺失 HVR1或HVR1的第13-27 位氨基酸能顯著促進(jìn) E2 誘導(dǎo)交叉中和抗體。
　　 結(jié)論：免疫兔得到的結(jié)果與免疫小鼠得到的結(jié)論是一致的，即HVR1顯著抑制 E2蛋白中其他抗體表位的免疫原性，用缺失HVR1或HVR1中第13-27 位氨基酸的E2蛋白可能是一種有效的丙型肝炎疫苗