四君子湯對(duì)TNBS誘導(dǎo)的UC大鼠結(jié)腸緊密連接蛋白表達(dá)的影響研究.pdf

1、背景:
　　炎癥性腸?。↖nflammatory bowel disease，IBD）是指一組病因不明的非特異性腸道炎癥，包括潰瘍性結(jié)腸炎(Ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn's disease，CD)，主要發(fā)生在結(jié)腸黏模層的炎性病變，以潰瘍糜爛為主，大部分會(huì)延伸影響到遠(yuǎn)端結(jié)腸和直腸，控制腸道黏膜屏障的炎癥在潰瘍性結(jié)腸炎病的臨床治療方面具有重要意義。該病臨床常為慢性持續(xù)、反復(fù)發(fā)作，但個(gè)別也可急劇起病

2、而呈暴發(fā)性。由于環(huán)境、個(gè)人生活習(xí)慣、飲食條件等變化，經(jīng)統(tǒng)計(jì)該病顯逐年增加的趨勢(shì)。
　　黏膜屏障是腸道最重要的一道屏障，由完整的腸上皮細(xì)胞(Intestinal epithel ialcell，IEC)和相鄰腸上皮細(xì)胞之間的連接構(gòu)成，調(diào)控著水和溶質(zhì)的跨上皮轉(zhuǎn)運(yùn)（如單糖、氨基酸、核苷酸、維生素及激素等）。研究認(rèn)為，黏膜上皮細(xì)胞及其細(xì)胞間的各種連接結(jié)構(gòu)是腸道顧護(hù)外環(huán)境中有害物質(zhì)或病原體入侵的關(guān)鍵，是維持腸上皮的選擇通透性及其功能的結(jié)構(gòu)基

3、礎(chǔ)。細(xì)胞間連接方式有多種，如緊密連接(Tightjunction，TJ)、縫隙連接(Gap junction，GJ)、黏附連接(Adherence junction，AJ)以及橋粒(Desmosome)等，TJ是細(xì)胞間最重要的連接方式。腸上皮細(xì)胞(IEC) TJ一旦發(fā)生變異、減少或缺失，IEC的間隙通透性就會(huì)增加，細(xì)菌、內(nèi)毒素及大分子物質(zhì)即可通過(guò)TJ進(jìn)入體循環(huán)。IBD特征就是IEC旁路通透性增高，允許腸腔內(nèi)病原菌及其毒素通過(guò)并進(jìn)入上皮下

4、層，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。因此，保護(hù)上皮屏障的緊密連接功能的完整性對(duì)防御與治療炎癥性腸病起著至關(guān)重要的作用。
　　四君子湯(SiJunzi Decoction，SJZD)出自宋代《太平惠民和劑局方》，為益氣健脾的代表方劑，臨床常用于治療脾虛證。多項(xiàng)臨床研究使用四君子湯單方、加減方或配合其他藥物治療潰瘍性結(jié)腸炎，療效顯著。課題組前期研究結(jié)果四君子湯可促進(jìn)小腸上皮細(xì)胞增殖、遷移與抑制凋亡，具有修復(fù)胃腸道受損黏膜與免疫調(diào)節(jié)的作用。由此，我們提

5、出工作假設(shè):四君子湯治療UC可能與影響腸道上皮緊密連接(TJ)蛋白表達(dá)有關(guān)。
　　目的:
　　建立大鼠實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎(UC)模型，以及體外腸道上皮屏障受損細(xì)胞模型，考察SJZD對(duì)腸道緊密連接蛋白表達(dá)的影響，探討SJZD通過(guò)影響緊密連接蛋白表達(dá)，修復(fù)腸道黏膜屏障，治療UC大鼠的分子機(jī)制，及其對(duì)NF-κB信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響。
　　方法:
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):
　　1.TNBS誘導(dǎo)的SD大鼠UC模型建立

6、　　將動(dòng)物稱重編號(hào)后，隨機(jī)區(qū)組法分為正常組(n=6)、TNBS50mg/kg(n=6)組、TNBS100mg/kg(n=6)組、TNBS150mg/kg(n=6)組。造模24h后，每天灌胃給予無(wú)菌水一次(10mL/kg)，觀察大鼠體重、飲食、精神狀態(tài)和糞便情況，給予DAI評(píng)分，連續(xù)10天。取大鼠血清和結(jié)腸，給予CMDI評(píng)分，并取病變結(jié)腸做病理切片HE染色進(jìn)行觀察，給予TDI評(píng)分，綜合選取合適的造模條件。
　　2.四君子湯對(duì)UC大鼠

7、的治療效果觀察
　　于造模后第二天開(kāi)始灌胃給予四君子湯，實(shí)驗(yàn)設(shè)正常組、TNBS造模組、SASP陽(yáng)性對(duì)照組、四君子湯復(fù)方給藥組（含低、中、高劑量）10天。觀察大鼠飲食、精神狀態(tài)、體重、大便性狀與隱血評(píng)分、大便次數(shù)與重量等情況，給予DAI評(píng)分。末次給藥后禁食24h，腹主動(dòng)脈收集大鼠血清。處死動(dòng)物取結(jié)腸部分，肉眼觀察結(jié)腸黏膜的病變并進(jìn)行結(jié)腸大體形態(tài)損傷評(píng)分(CMDI)，取病變部位進(jìn)行HE染色，光鏡下評(píng)價(jià)黏膜病理學(xué)損傷指數(shù)(TDI)，分析

8、四君子湯對(duì)TNBS誘導(dǎo)的SD大鼠潰瘍性結(jié)腸炎的治療作用情況。
　　3.四君子湯對(duì)UC大鼠結(jié)腸緊密連接mRNA和蛋白表達(dá)的影響
　　采用RT-PCR法檢測(cè)大鼠病變結(jié)腸組織緊密連接蛋白o(hù)ccludin、claudin-2基因表達(dá)，并采用免疫組化法分析大鼠結(jié)腸中緊密連接蛋白o(hù)ccludin、claudin-2的表達(dá)影響，計(jì)算各組平均光密度。
　　4.四君子湯對(duì)UC大鼠結(jié)腸炎癥因子mRNA表達(dá)與血清中炎癥因子分泌的影響

9、　　采用Real-Time PCR法檢測(cè)四君子湯治療后大鼠結(jié)腸中炎癥因子IL-6、TNF-a、IFN-γ、 IL-1βmRNA表達(dá)，并使用Elisa法檢測(cè)大鼠血清中IL-6、TNF-a、IFN-γ、IL-1β、小腸三葉肽TFF-3的含量。
　　體外實(shí)驗(yàn):
　　1.TNBS誘導(dǎo)的人結(jié)腸癌Caco-2細(xì)胞損傷模型建立
　　使用不同濃度TNBS溶液（200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL）損傷

10、Caco-2細(xì)胞不同時(shí)間(4h、6h、12h、24h、48h)制作Caco-2細(xì)胞炎癥模型，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，確定合適的TNBS造模濃度與損傷時(shí)間。
　　2.SJZD總多糖中的多糖含量測(cè)定與簡(jiǎn)單質(zhì)量控制
　　使用硫酸苯酚法測(cè)定SJZD總多糖中多糖的含量，并對(duì)SJZD總多糖的穩(wěn)定性進(jìn)行考察。另外，采用BCA法檢測(cè)了總多糖中蛋白質(zhì)的含量。
　　3.SJZD總多糖對(duì)Caco-2損傷模型的生長(zhǎng)保護(hù)作用
　　細(xì)胞經(jīng)TN

11、BS損傷造模之后，給予不同濃度SJZD總多糖(70μg/mL-200μg/mL)治療，給藥不同時(shí)間(24h、36h、48h)，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，評(píng)價(jià)SJZD總多糖最佳給藥濃度。
　　4.四君子湯總多糖對(duì)TNBS損傷Caco-2細(xì)胞緊密連接蛋白的影響
　　實(shí)驗(yàn)設(shè)正常組、模型組、總多糖給藥組，同時(shí)設(shè)定不同給藥時(shí)間(包括24h、36h、48h)，RT-PCR法檢測(cè)緊密連接蛋白claudin-1，2，4、ZO-1，2，3、occ

12、ludin、E-cad、JAM mRNA的表達(dá)，并采用Western-blot法檢測(cè)claudin-1、occludin與ZO-3，蛋白表達(dá)的情況。
　　5.四君子湯總多糖對(duì)TNBS損傷Caco-2細(xì)胞NF-κB通路的影響
　　實(shí)驗(yàn)分正常組、模型組、總多糖給藥組，給藥時(shí)間設(shè)6、9、12h。提取給藥后的細(xì)胞核蛋白，分別使用NF-κB p50/p65 Tanscription Factor Assay Kit和Western-B

13、lot法檢測(cè)核蛋白中NF-κB的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　體內(nèi)實(shí)驗(yàn):
　　1.50mg/kg-150mg/kg TNBS均可誘導(dǎo)SD大鼠結(jié)腸出現(xiàn)黏膜損傷，制備出潰瘍性結(jié)腸炎病理模型，模型可持續(xù)10天以上，其中以TNBS100mg/kg、150mg/kg的結(jié)腸損傷作用更加顯著。從模型穩(wěn)定性與造模成本等因素上考慮，我們選用TNBS100mg/kg作為體內(nèi)研究造模劑量。
　　2.四君子湯可降低TNBS誘導(dǎo)的UC大鼠DAI

14、、CDMI、TDI評(píng)分值。HE染色結(jié)果表明SJZD具有修復(fù)損傷黏膜的作用，其中以中高劑量組（生藥量5.6 g/kg）的治療效果最明顯。
　　3.大鼠結(jié)腸緊密連接蛋白o(hù)ccludin與claudin-2主要分布在上皮細(xì)胞之間，TNBS誘導(dǎo)可降低大鼠結(jié)腸組織occludin、claudin-2mRNA的表達(dá)，同時(shí)可使occludin與claudin-2蛋白表達(dá)量降低。SJZD中高劑量組(生藥量2.8 g/kg，5.6 g/kg)可顯著

15、性恢復(fù)大鼠結(jié)腸緊密連接蛋白的表達(dá)。
　　4.模型組大鼠結(jié)腸組織中的TNF-α、IFN-γ、 IL-6 mRNA表達(dá)較對(duì)照組顯上升的趨勢(shì)，四君子湯中高劑量（生藥量2.8 g/kg，5.6 g/kg）組可降低結(jié)腸中TNF-α、IFN-γ mRNA表達(dá)，低中高劑量(生藥量1.4g/kg，2.8 g/kg，5.6 g/kg)對(duì)IL-6 mRNA表達(dá)均有下調(diào)作用。模型組大鼠血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β含量較對(duì)照組均升高

16、，IL-1β的升高值具有顯著性差別(P＜0.05)，小腸三葉因子TFF-3表達(dá)下降。四君子湯可降低大鼠血清中炎癥因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β的含量，升高小腸三葉因子TFF-3的含量。
　　體外實(shí)驗(yàn):
　　1.不同濃度TNBS對(duì)Caco-2細(xì)胞均有一定的活力抑制作用，并呈一定的劑量和時(shí)間依賴性。我們選擇TNBS200μg/mL的濃度損傷細(xì)胞24h作為造模條件，結(jié)果表明可造成穩(wěn)定的細(xì)胞損傷模型。
　　2

17、.四君子湯總多糖的多糖含量約為70％，一年內(nèi)多糖含量穩(wěn)定。蛋白質(zhì)含量約為20％。
　　3.四君子湯總多糖濃度在100-150μg/mL之間對(duì)受損的Caco-2細(xì)胞均有修復(fù)作用，其中以120μg/mL作用最顯著。
　　4.四君子湯總多糖給藥24、36、48h內(nèi)對(duì)受損Caco-2細(xì)胞緊密連接蛋白claudin-1，2，4、ZO-1，2，3、occludin、E-cad mRNA表達(dá)有上調(diào)作用，其中以ZO-3、occludin、c

18、laudin-1較為明顯。對(duì)緊密連接蛋白JAM mRNA影響不明顯。同時(shí)，SJZD總多糖可上調(diào)受損細(xì)胞ZO-3、occludin、claudin-1蛋白表達(dá)。
　　5.TNBS造模后Caco-2細(xì)胞細(xì)胞核中NF-κB含量升高，四君子湯總多糖給藥9h可下調(diào)損傷后的Caco-2細(xì)胞細(xì)胞核中NF-κB的含量，結(jié)果與模型組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　四君子湯通過(guò)影響結(jié)腸上皮細(xì)胞黏膜的緊密連接蛋白表達(dá)，