四君子湯對(duì)小鼠神經(jīng)元表達(dá)蛋白質(zhì)組的影響.pdf

1、目的：在建立小鼠神經(jīng)元表達(dá)蛋白質(zhì)組分析方法的基礎(chǔ)上，通過復(fù)方中藥制劑四君子湯對(duì)小鼠大腦神經(jīng)元的作用，并與單藥制劑黨參、西藥胰島素和無藥作用相比較，進(jìn)行神經(jīng)元表達(dá)蛋白質(zhì)組的差異性分析，以探討中藥及其復(fù)方制劑對(duì)細(xì)胞的藥理作用，了解藥物對(duì)細(xì)胞、組織器官或生物體的綜合作用，為全面準(zhǔn)確地評(píng)價(jià)由復(fù)雜生物活性物質(zhì)組成的中藥及其復(fù)方制劑的作用機(jī)制和藥效提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法：培養(yǎng)出生1～3天的小鼠大腦神經(jīng)元，隨機(jī)分為復(fù)方組(四君子湯)、單藥組(黨

2、參)、西藥組(胰島素)和對(duì)照組。復(fù)方組加入四君子湯(由黨參、白術(shù)、茯苓、灸甘草四味中藥組成)，其中黨參生藥濃度為500mg/ml；單藥組加入黨參，其生藥濃度為500mg/ml；西藥組加入胰島素100mmol/L；對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)基。37℃孵育20分鐘，-70℃終止反應(yīng)后，裂解細(xì)胞，提取全細(xì)胞蛋白。Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，雙向電泳分離。一向采用pH4-7的固相pH梯度等電聚焦(isoelectric focusing gel

3、 eleclrophoresis，IEF)，二向采用濃度10％的十二烷基磺酸鈉．聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodiumdodecyl sulphate-polyacrylamide gel eleetrophoresis，SDS-PAGE)，銀染法染色，PDQuest 2D軟件對(duì)雙向電泳圖譜進(jìn)行差異分析。從凝膠中切取差異蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，運(yùn)用基質(zhì)輔助激光解吸附離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(matrix assisted laser desorption io

4、nization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)鑒定蛋白質(zhì)。 結(jié)果：復(fù)方中藥制劑作用于小鼠神經(jīng)元與其他對(duì)照組的表達(dá)蛋白質(zhì)組雙向電泳圖譜比較存在著明顯的差異，表現(xiàn)為圖譜中蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)目及灰度值的改變。利用PDQuest 2D軟件對(duì)雙向電泳圖譜進(jìn)行差異分析，初步篩選出10個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)。采用MALDI-TOF-MS檢測(cè)得到這10個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的肽指紋圖譜，再結(jié)合其實(shí)驗(yàn)分子量、等

5、電點(diǎn)等信息，以Aldente程序檢索Swiss-Prot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，對(duì)各蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行匹配鑒定。確定了與四君子湯作用相關(guān)的蛋白質(zhì)包括： ①磷蛋白：鋅指蛋白148、蛋白激酶Chk2、UPF0415蛋白C7orf25同源物、神經(jīng)絲M蛋白、TRAF家族成員相關(guān)的NF-κ-B激動(dòng)劑； ②信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)蛋白：Ras相關(guān)蛋白R(shí)ab-14、Ras相關(guān)蛋白R(shí)ab-3D； ③翻譯相關(guān)因子：真核翻譯起始因子3亞基5； ④膜蛋白

6、：肌漿網(wǎng)/肌內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣ATP酶2、跨膜肽酶A亞基α等。 結(jié)論： ①復(fù)方中藥四君子湯作用于小鼠神經(jīng)元的表達(dá)蛋白質(zhì)組與其他對(duì)照組比較存在明顯的差異。 ②經(jīng)質(zhì)譜鑒定和生物信息學(xué)分析，確定了真核翻譯起始因子3亞基5、跨膜肽酶A亞基α、鋅指蛋白148、蛋白激酶Chk2、Ras相關(guān)蛋白R(shí)ab-14、UPF0415蛋白C7or125同源物、神經(jīng)絲M蛋白、TRAF家族成員相關(guān)的NF-κ-B激動(dòng)劑、Ras相關(guān)蛋白R(shí)ab-3D、肌漿網(wǎng)