中國漢族人房顫易感基因關(guān)聯(lián)分析及朊蛋白相關(guān)疾病治療藥物的篩選研究.pdf

1、心房顫動(atriAlfibrillation, AF) 簡稱房顫，是一種最為常見的心律失常。中國目前約有一千萬房顫患者，房顫已成為嚴(yán)重影響我國公眾健康的疾病。對其發(fā)病機(jī)制的深入研究，一直是心律失常研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。關(guān)于該病的發(fā)生機(jī)制，先后提出了“局灶驅(qū)動”、“多環(huán)折返”和“自旋波理論”等學(xué)說。近來還發(fā)現(xiàn)一些非離子通道基因突變與房顫的發(fā)生緊密關(guān)聯(lián)，這不僅豐富了對房顫發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識，也為將來實現(xiàn)個體化治療提供了理論基礎(chǔ)。過去的研究主要依賴于

2、房顫家系的基因連鎖分析。但這些病例只占到所有房顫患者的很少一部分，更多的是普通房顫，為多基因疾病，其發(fā)病機(jī)制可能是由多個基因或者基因-環(huán)境相互作用引起。以往，傳統(tǒng)的多基因疾病的研究模式，是以假說為導(dǎo)向，即首先假設(shè)某基因為致病候選基因，再對其進(jìn)行深入研究，無異于大海撈針，即使成功也存在很多偶然性。隨著人類基因組計劃的完成和后續(xù)工作的展開，生命科學(xué)研究已經(jīng)進(jìn)入了快速、準(zhǔn)確、低耗地分析遺傳和表達(dá)的信息時代，新一代測序技術(shù)和生物信息分析平臺的誕

3、生使多基因疾病的研究手段逐漸加強(qiáng)。目前方興未艾的全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-Wide Association Studies, GWAS)正是基于人類基因組計劃（Human Genome Project, HGP）和人類基因組單體型圖計劃（The InternationAlHapMap Project, HapMap）的研究成果發(fā)展起來的一種研究手段。該技術(shù)能快速、簡便地在覆蓋全基因組的范圍內(nèi)提供與疾病表現(xiàn)型 (Phenotype)

4、 相關(guān)聯(lián)的遺傳差異 (Genotype)，為易感基因的尋找提供了準(zhǔn)確的定位信息。
　　 2007年，冰島人大規(guī)模的房顫“病例-對照”全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)位于4 號染色體長臂2 區(qū)5 帶（4q25）的單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphism, SNP) rs2200733與心房顫動高度關(guān)聯(lián)，隨后在多個種族人群包括我們所報道的中國漢族人群中，證實與房顫緊密關(guān)聯(lián)。然而在rs2200733所處的連鎖

5、不平衡區(qū)域內(nèi)并無已知功能基因的存在。 因此，正如大部分報道所認(rèn)為，位于rs2200733上游約150kb 處PITX2基因可能是潛在的易感基因，因為已知PITX2是指導(dǎo)機(jī)體多個器官包括心臟發(fā)育的一種重要信號分子。但到目前為止，無論是從基因水平或是基因表達(dá)水平，仍然缺乏直接證據(jù)可證實PITX2參與影響房顫發(fā)生?！癙ITX2基因是否參與房顫的發(fā)生？”這留給我們一個亟待證實的問題。
　　 在本研究中，我們選擇了PITX2基因上3個SN

6、Ps rs976568、rs994978和rs2595104，運(yùn)用“病例-對照”方法，在中國漢族人群中進(jìn)行了與房顫之間的關(guān)聯(lián)分析，首次從遺傳學(xué)角度上考證PITX2是否為中國漢族人群房顫的易感基因。
　　 第一部分，目的：探討PITX2基因上的3個SNPs：rs976568、rs994978和rs2595104與中國漢族人群心房顫動的相關(guān)性。
　　 方法：從中國漢族人群基因ID庫中隨機(jī)挑選371例房顫患者基因組DNA和62

7、0例非房顫患者對照基因組DNA，利用高分辨率溶解曲線 (high resolution melting, HRM)基因分型方法，同時對rs976568，rs994978 and rs2595104進(jìn)行基因分型，利用PLINK v1.05 軟件進(jìn)行哈迪-溫伯格（Hardy-Weinberg, HW）平衡檢驗。3個SNPs的基因頻率及基因型頻率與房顫的關(guān)聯(lián)用Pearson 2×2 以及2×3 列聯(lián)表分析，顯著程度用卡方檢驗計算 (SPSS,

8、 version 13.0)。相對危險度 (odd ratio, OR) 以及95％置信區(qū)間（confidence intervals, Cis) 用卡方檢驗計算 (SPSS, version 13.0)?；貧w性p值用Logistic 多因素回歸分析 (SPSS, version 13.0)，以性別、年齡、2型糖尿病、高血壓腦卒中等指標(biāo)作為協(xié)變量。當(dāng)“病例-對照”群體進(jìn)行分層后，p值將會使用Bonferroni’s correction

9、 來進(jìn)行矯正。利用PLINK v1.05 軟件進(jìn)行100, 000次Monte Carlo 模擬以衡量經(jīng)驗性p值。利用Haploview v4.2構(gòu)建單倍體型和連鎖不平衡（linkage disequilibrium, LD）模型。單倍體型頻率與房顫的關(guān)聯(lián)用Pearson 2×2列聯(lián)表分析，顯著程度用卡方檢驗計算(SPSS, version 13.0)。OR 以及95％置信區(qū)間用卡方檢驗計算(SPSS, version 13.0)。統(tǒng)計

10、效力的分析使用nQuery Advisor 6.0軟件。
　　 結(jié)果：統(tǒng)計效力分析顯示該研究的樣本數(shù)能提供足夠的統(tǒng)計效率。3個SNPs的對照組基因型均符合HW平衡。其中，rs2595104與房顫的關(guān)聯(lián)具有極顯著統(tǒng)計學(xué)意義，觀察P值為4.88×10-4，風(fēng)險等位基因為T等位基因，OR值是1.39，OR的95％置信區(qū)間為1.15 到1.66。Rs976568與房顫的關(guān)聯(lián)接近統(tǒng)計學(xué)顯著意義，觀察P值為0.054。Rs994978與房顫

11、不具有統(tǒng)計學(xué)顯著意義，觀察P值分別為0.078。3個SNPs的基因型均顯示與房顫的關(guān)聯(lián)。在隱性遺傳模式下，rs976568、 rs994978及rs2595104的基因型均獲得極顯著關(guān)聯(lián)，觀察P值分別為0.003、0.004及0.002。通過構(gòu)建rs976568-rs994978-rs2595104單倍體，發(fā)現(xiàn)可觀察到5種單倍體形式，G-T-T為50.0％，T-C-G為41.1％，G-C-G為3.5％，G-T-G為2.8％，T-C-T為

12、1.2％。其中只有G-T-T和G-T-G單倍型與房顫的關(guān)聯(lián)顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。觀察P值分別為0.005和0.003。
　　 結(jié)論： PITX2基因為房顫的易感基因心房顫動，單核苷酸多態(tài)性，PITX2，rs976568，rs994978，rs2595104，單倍體，關(guān)聯(lián)分析。
　　 第二部分，目的：建立蛋白質(zhì)錯誤折疊循環(huán)擴(kuò)增（protein misfolding cyclic amplification, PMCA）技術(shù)

13、，體外篩選能抑制細(xì)胞型朊蛋白(cellular prion protein, PrPc)向感染性朊蛋白(scrapie prion protein, PrPsc)轉(zhuǎn)化的藥物。
　　 方法：將感染羊瘙癢因子H22＃發(fā)病倉鼠腦組織勻漿與正常倉鼠腦組織勻漿混合，經(jīng)反復(fù)超聲-孵育后，Western Blot 檢測擴(kuò)增產(chǎn)物中PrPsc的含量，優(yōu)化最佳擴(kuò)增條件，用于體外抑制藥物篩選；利用針對人PrPc不同結(jié)構(gòu)域的抗體研究抑制藥物對PrPc空