膽管轉(zhuǎn)分化對(duì)斑馬魚(yú)肝臟嚴(yán)重受損后的修復(fù)作用.pdf

1、肝臟是人體最大的內(nèi)臟器官，具有分泌膽汁、消化和代謝脂肪、合成和分泌氨基酸、合成和儲(chǔ)存糖原、儲(chǔ)存和過(guò)濾血液、解毒及排除廢物、分泌血清白蛋白以維持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等多種重要功能。肝臟發(fā)揮正常生理功能是保障人口健康的基本要素之一。對(duì)于惡性肝臟疾病如肝癌，迄今為止最有效的治療和防止病情惡化的方式就是手術(shù)切除癌變部分肝臟，但是由此會(huì)導(dǎo)致患者的肝臟功能大大減弱，因此促進(jìn)肝臟再生以使得受損肝臟恢復(fù)功能至關(guān)重要。與脊椎動(dòng)物的其它器官相比，肝臟的再生能力較

2、強(qiáng)，在正常肝臟中的肝細(xì)胞雖然是靜默不分裂的，但是肝細(xì)胞卻擁有強(qiáng)大的分裂增殖能力并可在肝損傷后迅速進(jìn)入細(xì)胞分裂周期。肝臟經(jīng)手術(shù)切除三分之二的大鼠或小鼠可在7-10天內(nèi)恢復(fù)100％的肝臟重量。當(dāng)肝臟細(xì)胞的增殖能力被抑制或者肝臟受到嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)，一部分肝臟前體細(xì)胞會(huì)參與肝臟再生的修復(fù)，但是對(duì)這些前體細(xì)胞鑒定和分離至今尚有突破性進(jìn)展。因此，建立更大程度的甚至肝臟完全損傷后再生的動(dòng)物模型，對(duì)于鑒定肝臟再生過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的內(nèi)源性肝臟前體細(xì)胞并深入

3、揭示肝臟再生的分子調(diào)控機(jī)制具有重要意義。在肝臟再生過(guò)程中，成熟的膽管細(xì)胞是否會(huì)轉(zhuǎn)分化為肝臟細(xì)胞到目前為止還沒(méi)有報(bào)道，在本研究中我們主要以斑馬魚(yú)為動(dòng)物模型探究肝臟嚴(yán)重受損后膽管細(xì)胞是否會(huì)轉(zhuǎn)分化為肝臟細(xì)胞來(lái)參與肝臟再生過(guò)程。
　　在本研究中，我們利用斑馬魚(yú)作為模式生物來(lái)研究肝臟再生的細(xì)胞來(lái)源和分子機(jī)制，首先我們構(gòu)建了藥物特異性誘導(dǎo)損傷肝臟細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)肝臟再生模型，通過(guò)大量的品系篩選和藥物優(yōu)化發(fā)現(xiàn)Mtz處理后可以使近100％的肝細(xì)

4、胞誘導(dǎo)凋亡并在撤去藥物后肝臟能夠恢復(fù)正常再生。BODIPY FL C5和糖原顯色PAS反應(yīng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到新生的肝臟細(xì)胞具有脂肪代謝、膽酸分泌和糖原儲(chǔ)存能力。因此我們構(gòu)建的斑馬魚(yú)肝臟再生模型是一種功能性的再生模型。
　　當(dāng)肝臟細(xì)胞被藥物特異性誘導(dǎo)損傷后，膽管變粗，膽管表皮細(xì)胞收縮同時(shí)有一小部分膽管細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)肝細(xì)胞的標(biāo)志物，再生中后期，所有的膽管細(xì)胞都失去了正常的形態(tài)并表達(dá)肝臟特異性的分子標(biāo)記，這表明膽管對(duì)肝臟再生起了重要作用。EdU標(biāo)

5、記實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)新生肝臟區(qū)域出現(xiàn)大量的增殖現(xiàn)象并且這些增殖細(xì)胞主要集中在膽管中。而再生的開(kāi)始階段，膽管細(xì)胞的增殖能力非常低，同時(shí)TUNEL實(shí)驗(yàn)未能檢測(cè)到膽管細(xì)胞在再生過(guò)程中發(fā)生凋亡，因此膽管細(xì)胞在肝臟受損的過(guò)程中保持了完整性，這表明膽管細(xì)胞在肝臟受損后可以轉(zhuǎn)分化為肝臟細(xì)胞。為了進(jìn)一步確定膽管細(xì)胞的向肝臟細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化現(xiàn)象，我們利用Cre-Loxp系統(tǒng)來(lái)追蹤膽管來(lái)源的肝臟細(xì)胞，再生后期70％的新生肝臟細(xì)胞都來(lái)源于膽管細(xì)胞。這些現(xiàn)象表明肝臟受損再生

6、過(guò)程中，膽管細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化同時(shí)增殖轉(zhuǎn)分化為肝臟細(xì)胞并對(duì)肝臟再生起了主要的貢獻(xiàn)作用。
　　為了進(jìn)一步確定膽管細(xì)胞在肝臟再生過(guò)程中的功能作用，我們?cè)谂咛グl(fā)育的早期抑制Notch信號(hào)來(lái)特異性的抑制膽管系統(tǒng)的發(fā)育，膽管系統(tǒng)發(fā)育受損的肝臟再生明顯受到抑制。同時(shí)我們利用膽管突變體證明了膽管細(xì)胞對(duì)肝臟再生的重要性。另外，在斑馬魚(yú)中用膽管毒性藥物處理早期胚胎發(fā)現(xiàn)即使對(duì)膽管微弱的毒副作用也會(huì)抑制膽管細(xì)胞向肝臟的轉(zhuǎn)分化和肝臟的正常再生。肝臟再生初期

7、膽管細(xì)胞開(kāi)始表達(dá)一些內(nèi)胚層和肝臟早期的特異性標(biāo)記因子，這也說(shuō)明膽管細(xì)胞轉(zhuǎn)分化會(huì)伴隨一個(gè)去分化為多功能細(xì)胞的過(guò)程。
　　熒光原位雜交偶聯(lián)抗體顯色發(fā)現(xiàn)除了早期內(nèi)胚層相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子外sox9b也會(huì)在膽管細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，再生初期膽管細(xì)胞并未發(fā)現(xiàn)增殖現(xiàn)象但是sox9b的表達(dá)已經(jīng)上調(diào)。在sox9b突變體中，膽管細(xì)胞向肝臟細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化受到抑制同時(shí)肝臟再生減慢，這說(shuō)明sox9b對(duì)膽管細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化具有重要作用。已有研究表明Sox9b是Notch信號(hào)

8、途徑的一個(gè)靶基因，當(dāng)抑制了Notch后肝臟再生減慢同時(shí)sox9b的表達(dá)下調(diào)。在肝臟受損的過(guò)程中，Notch的靶基因hes5在膽管中上調(diào)，這說(shuō)明Notch通過(guò)介導(dǎo)sox9b來(lái)參與了膽管細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化過(guò)程。
　　綜上所述，本研究成功構(gòu)建了斑馬魚(yú)肝臟嚴(yán)重受損模型，鑒定了與肝臟受損相關(guān)的信號(hào)機(jī)制，并首次表明斑馬魚(yú)肝臟在幾乎100％受損后，乃然可進(jìn)行再生;并揭示在受損肝臟的再生修復(fù)過(guò)程中，成熟膽管細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化起了重要作用;同時(shí)也證明膽管細(xì)胞的