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文檔簡介
1、創(chuàng)傷性腦損傷(traumaticbraininjury,TBI)是一種嚴重影響人們生活質(zhì)量的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷。大多數(shù)TBI病人長期遭受認知、運動和感覺等功能缺陷后遺癥困擾,給患者、患者家庭和社會帶來了沉重的負擔。盡管科研工作者在如何治療TBI后遺癥方面進行了長期不懈地努力,然而截止目前仍然沒有找到有效的治療方法,特別是認知功能缺陷(cognitivedeficits)仍然是困擾醫(yī)療界的一個難題。
為了攻克TBI后遺癥,科學
2、家們嘗試了各種各樣的方法,越來越多的證據(jù)表明細胞移植是其中最有應用前景的治療手段之一。目前有多種細胞被用于臨床和實驗研究。理論上來說,胚胎干細胞(embryonicstemcells,ESCs)是細胞移植的最佳種子細胞,但是由于受倫理道德和胚胎組織來源不足等因素的的限制,ESCs很難在實驗研究和臨床上應用推廣。目前在實驗研究和臨床上使用得最為廣泛的種子細胞是骨髓間充質(zhì)干細胞(bonemarrowstromalcells,BMSCs),然
3、而BMSCs的增殖和分化能力會隨著供者年齡的增長而顯著下降,而且BMSCs的獲取過程是一個疼痛的有創(chuàng)操作過程。所以尋找新的干細胞替代來源仍然是十分必要的。近年來一種新的細胞引起了科研工作者的廣泛關注,這種細胞叫人臍帶間充質(zhì)干細胞(humanumbilicalmesenchymalstemcells,HUMSCs)。HUMSCs不是來源于臍帶血而是來源于臍帶間充質(zhì)的干細胞,相對于ESCs或BMSCs,HUMSCs具有以下優(yōu)點:(1)無倫理
4、道德爭議;(2)來源豐富,體外增殖能力強;(3)獲取方便,無痛無創(chuàng)。HUMSCs的以上優(yōu)點引起了細胞移植方面科研工作者的極大興趣。
近來,有些團隊報道HUMSCs可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子(neurotrophins),并且對中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病表現(xiàn)出治療作用。另一方面,有些實驗室報道HUMSCs在體外可分化為神經(jīng)樣細胞,但是受到另外一些團體的質(zhì)疑。前不久,我們用Hermann等的方法在體外成功地將HUMSCs轉分化為具有神經(jīng)干細胞(
5、neuralstemcells)特點的臍帶間充質(zhì)干細胞源神經(jīng)球(humanumbilicalmesenchymalstemcells-derivedneurospheres,HUMSC-NSs),我們接著將這些HUMSC-NSs移植到脊髓全橫斷大鼠模型中,10周后,一些HUMSC-NSs在體內(nèi)分化為神經(jīng)樣細胞并對運動功能恢復表現(xiàn)出了促進作用。那么,轉分化和未轉分化的臍帶間充質(zhì)干細胞到底誰的效果更好呢?據(jù)我們了解,目前還沒有在相同條件下的
6、比較研究報道。事實上,關于間充質(zhì)干細胞移植前是否需要轉分化一直存在爭議。所以,進行間充質(zhì)干細胞轉分化前后的比較研究是迫切需要的。
基于以上背景,本課題選用HUMSCs為本研究的種子細胞,首先建立HUMSCs的分離和培養(yǎng)方法,并研究臍帶間充質(zhì)干細胞的生物學特性,為臨床治療的種子細胞刷選提供理論依據(jù)。其次,用改良的兩步法對HUMSCs向神外胚層細胞方向進行轉分化,檢測HUMSCs是否能跨胚層轉分化為神經(jīng)樣細胞。最后,將HUMS
7、Cs-NSs和HUMSCs移植到TBI大鼠模型上,對他們的治療效果進行比較,以確認移植前的轉分化是否有必要。同時探討細胞移植治療腦損傷的可能機制。考慮到將HUMSCs-NSs和HUMSCs移植到大鼠腦內(nèi)是異種移植,我們還對HUMSCs-NSs和HUMSCs進行了免疫排斥檢測。本論文包括以下三個章節(jié):
第一章:人臍帶間充質(zhì)干細胞的分離、培養(yǎng)和鑒定
目的:建立分離、培養(yǎng)人臍帶基質(zhì)干細胞(HUMSCs)的方法,了解
8、其生物學特性。
方法:采用膠原酶消化法從足月妊娠健康新生兒的臍帶,通過貼壁法獲得原代培養(yǎng)的HUMSCs,并進行傳代擴增,并對其一般形態(tài)和體外擴增能力進行觀察分析,同時通過流式細胞檢測對其免疫表型進行鑒定。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準誤((x)±SE)表示,并用統(tǒng)計軟件SPSS13.0進行統(tǒng)計分析。用單因素ANOVA分析對P1至P25代HUMSCs的倍增時間進行進行統(tǒng)計分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計意義。
結果:用膠
9、原酶消化法從臍帶中成功地分離培養(yǎng)出了HUMSCs。光鏡觀察見HUMSCs具備典型的MSCs的形態(tài)學特征。流式檢測結果顯示:HUMSCs高表達間充質(zhì)標記物CD73(99.18%),CD90(97.90%),CD105(96.05%)和粘附分子CD29(99.12%),CD44(99.97%),CD166(99.11%);低表達造血系細胞表面標記物CD34(0.05%),CD45(0.91%),血管內(nèi)皮性抗原CD31(0.02%),人類白細
10、胞抗原HLA-DR(0.17%)和細胞表面標記物CD19(0.10%)。傳代培養(yǎng)顯示HUMSCs具備較強的體外擴增能力,第1-25代HUMSCs之間的倍增時間波動于26.74~27.68小時之間,經(jīng)單因素ANOVA統(tǒng)計分析,結果顯示第1-25代HUMSCs倍增時間之間的差異無顯著性(F值=0.056,P值=0.785),說明整體而言每代細胞倍增時間無顯著差異,細胞增殖能力不因傳代而下降。
結論:本研究通過膠原酶消化法成功建
11、立了HUMSCs體外培養(yǎng)體系。HUMSCs具有較強的體外擴增能力,多次傳代后增殖特性穩(wěn)定,細胞免疫表型與典型MSCs相似,符合國際細胞治療協(xié)會的間充質(zhì)干細胞標準,是一種理想的成體干細胞,有望成為細胞移植的理想種子細胞。
第二章:人臍帶間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)外胚層樣細胞的轉分化研究
目的:建立HUMSCs——HUMSC-NSs——神經(jīng)樣細胞的兩步轉分化方法。通過以上兩步轉分化法,首先為體內(nèi)移植治療TBI的研究提供無
12、倫理道德爭議神經(jīng)干細胞源,其次對HUMSCs在體外是否能轉分化為神經(jīng)樣細胞進行驗證。此外,在體外對轉分化的HUMSCs(即HUMSC-NSs)和未轉分化的HUMSCs的神經(jīng)營養(yǎng)因子分泌能力進行比較,為在體內(nèi)研究移植前的轉分化是否有必要提供一些實驗依據(jù)。
方法:首先用神經(jīng)培養(yǎng)基(neurobasalmedium),表皮生長因子(epidermalgrowthfactor,EGF),堿性成纖維生長因子(basicfibrobl
13、astgrowthfactor,bFGF),神經(jīng)培養(yǎng)添加劑B27在體外將HUMSCs誘導為HUMSC-NSs,并對HUMSC-NSs是否表達神經(jīng)干細胞標記物nestin進行免疫細胞化學檢測。然后進一步用neurobasalmedium,N2,胎牛血清,馬血清和全反式維甲酸對HUMSC-NSs進行終末誘導分化,并用免疫細胞化學和Westernblot對終末誘導分化結果進行檢驗。最后采用Elisa對HUMSCs條件培養(yǎng)基和HUMSC-NSs
14、條件培養(yǎng)基中的BDNF和NT-3蛋白水平進行檢測。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準誤((x)±SE)表示,并用統(tǒng)計軟件SPSS13.0進行統(tǒng)計分析。對HUMSCs條件培養(yǎng)基和HUMSC-NSs條件培養(yǎng)基中的BDNF和NT-3ELISA檢測結果,采用t檢驗進行比較分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計意義。
結果:通過本實驗方案在體外成功地將HUMSCs誘導為具有神經(jīng)干細胞特點的HUMSC-NSs,經(jīng)免疫細胞化學檢測HUMSC-NSs為ne
15、stin強陽性,而且HUMSC-NSCs具有自我更新能力。HUMSC-NSs經(jīng)終末誘導分化14天后,表達β-tubulinⅢ、GalC、GFAP和MAP2ab神經(jīng)標記物的細胞比例分別為:19.2±3.0%、27±2%、42.8±3.8%和4.4±1.8%。而作為對照的未轉分化的HUMSCs不表達以上神經(jīng)標記物。Elisa檢測結果顯示:HUMSCs條件培養(yǎng)基中的BDNF蛋白水平(128.75±9.22pg/ml)顯著高于HUMSC-NSs
16、條件培養(yǎng)基中的BDNF蛋白水平(81.36±8.39pg/ml)(t=3.802,P=0.003)。而且HUMSCs條件培養(yǎng)基中的NT-3蛋白水平(97.79±8.18pg/rl)也顯著高于HUMSC-NSs條件培養(yǎng)基中的NT-3蛋白水平(67.53±8.45pg/ml)(t=2.574,P=0.028)。
結論:通過本實驗方案成功建立了HUMSCs向神經(jīng)外胚層樣細胞轉分化的兩步誘導方案。HUMSC-NSs具備大部分神經(jīng)系
17、統(tǒng)來源NSCs的典型特征,為NSCs的獲取提供了新的來源。HUMSCs在體外可最終分化為神經(jīng)樣細胞,說明HUMSCs在體外可實現(xiàn)跨胚層轉化。轉分化在提高HUMSCs向神經(jīng)樣細胞分化能力的同時卻降低HUMSCs分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的能力,所以HUMSCs和HUMSCs-NSs誰的效果更好,還有待體內(nèi)實驗驗證。
第三章轉分化和未轉分化人臍帶間充質(zhì)干細胞在腦損傷后認知功能修復中的比較研究
目的:在TBI大鼠模型上,比較
18、HUMSCs和HUMSC-NSs治療效果,以確定間充質(zhì)干細胞移植前的轉分化是否有意義,同時探討細胞移植治療TBI的機制。
方法:改良自由落體打擊裝置制作成年SD大鼠TBI模型。實驗動物隨機分為4組:HUMSCs組、HUMSC-NSs組、Matrigel組和假手術組。損傷7天后,將10μLDiI標記的HUMSCs和HUMSC-NSsMatrigel細胞懸液(含1×105個細胞)用微量注射器分別移植到HUMSCs移植組和HUM
19、SC-NSs組受損海馬內(nèi),損傷對照組注射10μLMatrigel,假手術組未接受任何移植,移植后不給動物使用任何免疫抑制劑。細胞移植術后24至28天采用Morris水迷宮實驗每天對各組動物進行認知功能評價。并從組織形態(tài)學修復(大體形態(tài)學觀察、H&E染色和空洞分析),免疫排斥反應、細胞在體內(nèi)的分化情況以及各組動物海馬組織提取液中的BDNF和NT-3蛋白水平這幾方面對HUMSCs和HUMSC-NSs進行綜合比較。實驗中的所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標
20、準誤((x)±SE)表示,并用統(tǒng)計軟件SPSS13.0進行統(tǒng)計分析。對各實驗組間空間學習記憶能力的比較采用重復測量資料的方差分析方法;為分析每一個時間點各組動物在的認知功能是否有差別,我們采用方差分析(one-wayANOVA)進行組間的多重比較,組間的多重比較采用LSD檢驗,方差不齊采用Welch法校正F檢驗及DunnettT3多重比較。各實驗組腦組織空洞分析采用單因素方差分析(one-wayANOVA),組間的多重比較采用LSD檢驗
21、,方差不齊采用Welch法校正F檢驗及DunnettT3多重比較。對HUMSCs移植組和HUMSCs-NSs移植組兩組間每種神經(jīng)細胞標記物的比較分析采用t檢驗。體內(nèi)海馬提取液中的BDNF和NT-3蛋白水平的比較采用單因素方差分析(one-wayANOVA),組間的多重比較采用LSD檢驗,方差不齊采用Welch法校正F檢驗及DunnettT3多重比較。以P<0.05為差異有統(tǒng)計意義。
結果:認知功能恢復情況:重復測量方差分析
22、結果顯示各組老鼠整體上顯示出顯著的分組效應(F=150.602,P<0.001)和時間效應(F=97.706,P<0.001)以及分組與時間的交互效應(F=4.125,P=0.001),說明分組因素和時間因素對各組動物空間學習記憶能力有影響,組間差異大小在不同時間點不一樣。進一步用單因素方差分析(one-wayANOVA)對每一個時間點各組動物在的認知功能進行組間的多重比較。發(fā)現(xiàn)從移植術后第25天開始兩個細胞移植組每天測得的逃避潛伏期明
23、顯比Matrigel組短(P<0.05),說明移植術后第25天開始細胞移植組的空間學習記憶能力強于Matrigel組。兩個細胞移植組之間相比較,在細胞移植后第27天開始,HUMSCs組每天測得逃避潛伏期比HUMSC-NSs組短(P<0.001),表明隨著時間的推延,HUMSCs組大鼠的空間學習記憶能力恢復得更好。
組織修復情況:腦組織大體形態(tài)學觀察顯示除假手術組腦組織中幾乎沒有缺損灶外,另外三個組腦組織均存在不同程度的缺損
24、灶。兩個細胞移植組缺損灶較Matrigel組小。相對而言,HUMSCs組的腦組織缺損灶似乎比HUMSC-NSs組小。進一步用Cavalieri法測量計算空洞體積百分率,我們發(fā)現(xiàn)假手術組、Matrigel組、HUMSCs組和HUMSC-NSs組的空洞體積百分率分別為:0.64±0.10%、11.38±0.67%、5.49±0.58%和8.15±0.47%。方差分析結果顯示F值=2.570,P值=0.083。可認為各組老鼠腦組織空洞體積百分
25、率存在顯著差異。用LSD法進行兩兩比較,發(fā)現(xiàn)3個腦損傷組腦組織空洞體積百分率都顯著大于假手術組(P值<0.001)。HUMSCs組和HUMSC-NSs組的空洞體積百分率都顯著小于Matrigel組空洞體積百分率(P值<0.001)。而且,HUMSCs組和HUMSC-NSs組的空洞體積百分率之間比較亦有顯著性差異(P值<0.05)。
免疫排斥情況:無論是HUMSCs還是HUMSC-NSs植入大鼠體內(nèi)28天后都沒有表現(xiàn)出任何明
26、顯地免疫排斥反應現(xiàn)象,如炎細胞浸潤,血管套形成等。組織切片用CD4(T輔助細胞表面標記物)、CD8(T殺傷細胞表面標記物)、CD11b(巨噬細胞表面標記物)和MPO(白細胞表面標記物)等抗體進行檢測,結果顯示:組織切片中以上抗體的免疫反應幾乎都可以忽略不計。進一步說明HUMSCs和HUMSC-NSs植入體內(nèi)后不會引起免疫排斥反應。
移植細胞分化情況:細胞移植28天后,HUMSCs組和HUMSC-NSs組海馬內(nèi)仍有DiI陽性
27、HUMSCs或HUMSC-NSs存在。大部分HUMSCs或HUMSC-NSs位于病變周圍靠近正常組織,也有一些移植細胞向損傷病灶中心遷移。免疫組織化學染色后計數(shù)并計算HUMSCs組和HUMSC-NSs組中DiI/β-tubulinⅢ,DiI/GalC,DiI/GFAP,DiI/MAP2ab雙陽性細胞占DiI陽性細胞得比例。結果發(fā)現(xiàn),在HUMSCs組DiI/β-tubulinⅢ,DiI/GalC,DiI/GFAP和DiI/MAP2ab雙陽
28、性細胞占DiI陽性細胞得比例分別為:5.71±0.52%,3.61±0.41%,5.62±0.60%和3.39±0.23%。而在HUMSC-NSs組DiI/β-tubulinⅢ,DiI/GalC,DiI/GFAP和DiI/MAP2ab雙陽性細胞占DiI陽性細胞得比例分別為:6.90±0.66%,4.01±0.43%,6.51±0.70%和3.12±0.28%。統(tǒng)計結果顯示HUMSCs組和HUMSC-NSs組的分化結果沒有統(tǒng)計差異:DiI
29、/β-tubulinⅢ(t=-1.418,P=0.178),DiI/GalC(t=-0.674,P=0.512),DiI/GFAP(t=-0.967,P=0.350)和DiI/MAP2ab(t=0.761,P=0.459)。說明無論是HUMSCs還是HUMSC-NSs在植入體內(nèi)后,絕大大部分都沒有向神經(jīng)外胚層細胞分化,二者分化結果無統(tǒng)計差異。
各組海馬提取液中BDNF和NT-3蛋白水平檢測結果:在假手術組、Matrigel
30、組、HUMSCs組和HUMSC-NSs組中的BDNF水平分別為:59.07±6.06pg/ml,130.80±10.40pg/ml,269.40±14.00pg/ml,190.47±15.24pg/ml。而相對應的各組NT-3蛋白水平分別為:23.54±3.38pg/ml,48.96±4.74pg/ml,128.97±13.46pg/ml和78.55±7.81pg/ml。方差分析顯示各組的BDNF(F值=67.754,P值<0.001)
31、,和NT-3(F值=30.003,P值<0.001)蛋白水平存在顯著差異。用DunnttT3檢驗進行多重比較。結果顯示與假手術組相比,三個海馬損傷組中的BDNF水平均顯著增高(P值<0.001)。而且,HUMSCs組和HUMSC-NSs組中的BDNF水平也顯著高于Matrigel組(HUMSCs組與Matrigelgroup相比P值<0.001;HUMSC-NSs組與Matrigelgroup相比,P值=0.025)。HUMSCs組和H
32、UMSC-NSs組的BDNF水平之間也存在顯著差異(P值=0.007)。有趣地是各實驗組海馬提取液中的NT-3蛋白水平的表現(xiàn)模式與BDNF相似。與假手術組比較,Matrigel組(P值=0.002)、HUMSCs組(P值<0.001)和HUMSC-NSs組(P值<0.001)中的NT-3蛋白水平都顯著增高。而且,HUMSCs組(P值<0.001)和HUMSC-NSs組(P值=0.026)中的NT-3蛋白水平較Matrigel組顯著增高。
33、HUMSCs組和HUMSC-NSs組的NT-3蛋白水平之間亦存在顯著差異(P值=0.026)。
結論:轉分化的HUMSCs和未轉分化的HUMSCs對TBI后的認知功能恢復都有促進作用,但是未轉分化的HUMSCs效果更好,而且轉分化后HUMSCs分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的能力顯著降低,所以移植前的轉分化可能不是必需的。同時,絕大多數(shù)植入細胞在體內(nèi)未分化為神經(jīng)樣細胞,說明體外的轉分化難以在體內(nèi)實現(xiàn),這也提示細胞替代作用不大可能是TBI
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