人臍帶源基質(zhì)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化及在脊髓損傷修復(fù)中的應(yīng)用研究.pdf

1、脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)是最嚴(yán)重的創(chuàng)傷之一,但同時也是治愈率最低、死亡率最高的疾病之一。隨著現(xiàn)代建筑業(yè)、交通運(yùn)輸業(yè)的發(fā)展,SCI的發(fā)生率也呈逐年上升趨勢,傳統(tǒng)的治療方法包括手術(shù)、藥物、康復(fù)理療和功能鍛煉等,但是療效都不理想。盡管如此,目前已開發(fā)出幾種可能取得突破的治療策略,并在動物模型上獲得初步的成功,細(xì)胞移植就是其中最有應(yīng)用前景的治療手段之一。
　　 已有多種類型的細(xì)胞被嘗試應(yīng)用于動物模型和臨床

2、Ⅰ、Ⅱ期隨機(jī)實(shí)驗(yàn)中。胚胎干細(xì)胞和中樞來源的神經(jīng)干細(xì)胞雖在理論上有較高的評價,但用于異體移植有較大免疫排斥反應(yīng),并且存在倫理上的限制。雪旺氏細(xì)胞和嗅鞘細(xì)胞療效也得到肯定,但受取材和擴(kuò)增能力的限制,也不適宜用于臨床。成體基質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stromal cells,MSCs)取材方便容易,體外易于大量擴(kuò)增,有免疫抑制功能,不受倫理道德影響,并可做基因的良好載體,因此,應(yīng)用MSCs有望成為臨床治療SCI的首選種子細(xì)胞。

3、>　　 本研究以人臍帶基質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord stromal cells,HUMSCs)為種子細(xì)胞,首先建立分離和培養(yǎng)HUMSCs的方法,全面了解其生物學(xué)特性及向骨,軟骨和脂肪細(xì)胞的分化潛能:其次在體外建立誘導(dǎo)HUMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells,NSCs)分化的方法,并對HUMSC轉(zhuǎn)分化而來的神經(jīng)干細(xì)胞(HUMSC-NSCs)進(jìn)行功能學(xué)鑒定；接下來,誘導(dǎo)HUMSC-NSCs向神經(jīng)細(xì)胞、少突膠

4、質(zhì)前體細(xì)胞和雪旺氏細(xì)胞定向分化,并對分化而來的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)、細(xì)胞表型和功能學(xué)鑒定；然后對HUMSCs和HBMSCs的生物學(xué)特征進(jìn)行全面比較,為SCI體內(nèi)治療種子細(xì)胞的篩選提供依據(jù)；最后聯(lián)合PLGA多孔支架和HUMSCs-NSCs治療大鼠脊髓全橫斷損傷,觀察其療效,并對其作用機(jī)制進(jìn)行探討。本論文包括五個章節(jié):
　　 第一章 人臍帶基質(zhì)細(xì)胞體外分離培養(yǎng)和鑒定
　　 目的:建立分離培養(yǎng)人臍帶基質(zhì)干細(xì)胞(HUMSCs)的方法,

5、充分了解其生物學(xué)特性。
　　 方法:采用膠原酶消化法獲得HUMSCs,并對細(xì)胞的一般形態(tài)、免疫表型、細(xì)胞周期、擴(kuò)增能力以及向骨、軟骨和脂肪細(xì)胞的多向分化能力進(jìn)行鑒定。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤((X)±SE)來表示,并應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析,用析因方差分析對P1和P25之間的細(xì)胞生長曲線進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。用單因素ANOVA檢驗(yàn)及LSD多重比較對第1-8代HUMSCs之間的倍增時間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意

6、義。
　　 結(jié)論:通過本研究,我們成功建立了分離培養(yǎng)HUMSCs的可靠方法。HUMSCs并具有較強(qiáng)的體外擴(kuò)增能力,細(xì)胞免疫表型與典型MSCs相似,具有成脂、成骨、成軟骨的多向分化潛能,是一種理想的成體干細(xì)胞來源。
　　 第二章 人臍帶基質(zhì)細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化研究
　　 目的:建立HUMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞分化的方法,并對HUMSC轉(zhuǎn)分化而來的神經(jīng)干細(xì)胞(HUMSC-NSCs)進(jìn)行形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和功能學(xué)鑒定,為N

7、SCs臨床移植治療SCI的研究提供無倫理道德爭議的細(xì)胞來源。
　　 方法:用表皮生長因子(Epidermal growth factor,EGF)和N2對HUMSCs進(jìn)行預(yù)誘導(dǎo)；比較預(yù)誘導(dǎo)和未經(jīng)誘導(dǎo)的HUMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞方向分化的效率。然后用人成纖維生長因子-2(Human basic fibroblast growth factor-2,FGF2),表皮生長因子(epidermal growth factor,EGF)以及

8、b27將預(yù)誘導(dǎo)后的HUMSCs向神經(jīng)干細(xì)胞方向分化。然后用免疫熒光化學(xué)、western blot對HUMSC-NSCs進(jìn)行組織學(xué)鑒定,最后把HUMSC-NSCs和人胚胎來源的NSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化的能力進(jìn)行比較。用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,采用成組t檢驗(yàn)比較HUMSCs和預(yù)誘導(dǎo)HUMSCs誘導(dǎo)而來的神經(jīng)球平均直徑和nestin陽性表達(dá)率,用單因素ANOVA及LSD多重比較定量分析HUMSC-NSCs的細(xì)胞倍增時間,以及未

9、分化HUMSCs,HUMSC-NSCs和終極分化的HUMSC-NSCs之間重要干細(xì)胞功能基因的表達(dá),以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:通過本實(shí)驗(yàn)成功建立了誘導(dǎo)HUMSCs向NSCs分化的方案,HUMSC-NSCs具備大部分神經(jīng)系統(tǒng)來源NSCs的典型特征,為NSCs用于臨床移植治療SCI解決了來源問題。但HUMSC-NSCs與中樞神經(jīng)來源的NSCs尚存在一定差別,當(dāng)前的方案仍需要進(jìn)一步改進(jìn)。
　　 第三章 人

10、臍帶基質(zhì)細(xì)胞源神經(jīng)干細(xì)胞的分化研究
　　 目的:建立HUMSC-NSCs向神經(jīng)細(xì)胞、雪旺氏細(xì)胞(Schwann cells,SCs)和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte precursor cells,OPCs)定向誘導(dǎo)分化的方法,為HUMSCs的多向分化潛能提供依據(jù),并為HUMSCs未來用于SCI后的神經(jīng)再生和髓鞘再生修復(fù)提供細(xì)胞來源。
　　 方法:通過建立不同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基,將HUMSC-NSCs誘導(dǎo)為神

11、經(jīng)細(xì)胞、SCs和OPCs,并以周圍神經(jīng)來源的SCs、胚胎來源的膠質(zhì)前體細(xì)胞(hESC-OPCs)為對照,對轉(zhuǎn)化而來的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和功能學(xué)鑒定。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示((X)±SE)。用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,用配對t、成組t檢驗(yàn)和單因素ANOVA及LSD多重比較的方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:這些誘導(dǎo)而來的細(xì)胞在形態(tài)學(xué)和組織學(xué)上與“真正的”神經(jīng)元、雪旺氏細(xì)胞

12、或少突膠質(zhì)前體細(xì)胞無異,但在功能學(xué)上均存在不同程度的差別。HUMSC-NSCs有向神經(jīng)細(xì)胞、雪旺氏細(xì)胞和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞定向分化的潛能,盡管具備一定的功能學(xué)特征,但目前的誘導(dǎo)方案不能保證HUMSC-NSCs分化而來的神經(jīng)細(xì)胞、雪旺氏細(xì)胞和少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的長期穩(wěn)定性。
　　 第四章 人臍帶基質(zhì)細(xì)胞與人骨髓基質(zhì)細(xì)胞生物學(xué)特性的比較研究
　　 目的:在體外對HUMSCs和HBMSCs在形態(tài)學(xué)、細(xì)胞的擴(kuò)增能力、向神經(jīng)細(xì)胞的分化

13、能力、神經(jīng)營養(yǎng)因子(NTFs)的分泌以及免疫抑制能力方面進(jìn)行詳細(xì)的比較學(xué)研究,為臨床種子細(xì)胞的篩選提供依據(jù)。
　　 方法:在細(xì)胞形態(tài)學(xué)方面,用光鏡和電鏡對HUMSCs和HBMSCs進(jìn)行觀察和比較；在細(xì)胞的體外擴(kuò)增能力方面,我們對細(xì)胞的擴(kuò)增曲線、倍增時間和細(xì)胞周期進(jìn)行分析和比較；在向神經(jīng)干細(xì)胞分化的能力方面,我們對骨髓源和臍帶源干細(xì)胞的擴(kuò)增能力和自我更新能力進(jìn)行了分析和比較；在分泌NTFs方面,我們用基因芯片對86個NTFs基因進(jìn)

14、行分析,然后對代表性差異的NTFs進(jìn)行組織化學(xué)染色鑒定芯片結(jié)果。最后用PCR和免疫組織化學(xué)對免疫相關(guān)的細(xì)胞因子進(jìn)行分析。
　　 結(jié)論:HUMSCs是HBMSCs理想的替代來源,將成為未來治療SCI最有潛力的MSCs之一。
　　 第五章 組織工程化人臍帶基質(zhì)干細(xì)胞源神經(jīng)干細(xì)胞移植治療成年大鼠脊髓全橫斷損傷的研究
　　 目的:組織工程技術(shù)治療SCI的基本模式為“種子細(xì)胞+生物支架”。基于前面研究基礎(chǔ)上,我們以HUMS

15、C-NSCs為種子細(xì)胞,以PLGA大孔支架為生物材料聯(lián)合治療大鼠脊髓全橫斷損傷,觀察其療效。同時以HBMSCs-NSCs為對照,比較二者在動物模型體內(nèi)的移植效果。
　　 方法:在體外構(gòu)建成年大鼠脊髓全橫斷損傷模型,將負(fù)載有細(xì)胞或生理鹽水的PLGA大孔支架移植于脊髓橫斷處。實(shí)驗(yàn)動物隨機(jī)分為A組:HUMSC-NSCs+PLGA組,B組:HBMSC-NSCs+PLGA組；C組:HUMSC-NSCs組；D:生理鹽水+PLGA組；E:假手

16、術(shù)組。主要從運(yùn)動功能評價(BBB評分、爬格子實(shí)驗(yàn)),組織形態(tài)學(xué)修復(fù)(大體形態(tài)學(xué)比較、HE染色、空洞修復(fù))、移植細(xì)胞在體內(nèi)的存活和分化(BrdU以及神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物免疫組織化學(xué)染色分析),軸突再生(NF-200,5-HT、TH、CGRP纖維再生情況,神經(jīng)束路逆行和順性追蹤觀察皮質(zhì)脊髓束纖維和背索上行感覺神經(jīng)纖維的再生情況)這幾方面進(jìn)行分析。所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示((X)±SE)。用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,以P<0.0

17、5為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對BBB評分和爬格子實(shí)驗(yàn)采用重復(fù)測量的ANOVA分析和LSD多重比較,其他數(shù)據(jù)均采用單因素ANOVA分析和LSD多重比較。
　　 結(jié)論:以HUMSC-NSCs為種子細(xì)胞聯(lián)合PLGA支架的治療策略,顯著促進(jìn)了脊髓全橫斷損傷后大鼠的軸突再生和功能修復(fù),且HUMSC-NSCs+PLGA治療組的療效明顯好于HBMSC-NSCs+PLGA治療組,但細(xì)胞的替代作用和皮質(zhì)脊髓束纖維再生顯然不能解釋相對顯著的功能恢復(fù),HU