脂肪干細(xì)胞神經(jīng)分化及對(duì)慢性壓迫性脊髓損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　慢性壓迫性脊髓損傷是脊髓長期受到漸進(jìn)行壓迫而出現(xiàn)的一類臨床多發(fā)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性損傷性病變，多見于脊柱退行性疾病，如頸椎病、椎間盤突出癥、椎管狹窄癥和后縱韌帶骨化癥等。隨著人類平均壽命的延長及生活和工作方式的改變，該疾病的發(fā)病率逐年上升，發(fā)病人群年輕化。脊髓慢性持續(xù)性受壓產(chǎn)生的各種病理生理改變，導(dǎo)致受壓部位以下運(yùn)動(dòng)、感覺和（或）自主神經(jīng)功能不可逆性障礙，甚至永久性的殘疾，包括癱瘓、感覺喪失、神經(jīng)性疼痛和直腸膀

2、胱功能障礙等，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和社會(huì)功能，給患者及其家庭帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失和心理生理負(fù)擔(dān)。目前，針對(duì)慢性壓迫性脊髓損傷的治療開展了廣泛的臨床治療研究，主要包括持續(xù)壓迫的手術(shù)減壓、不穩(wěn)定病變的融合穩(wěn)定、藥物治療（如激素沖擊治療、清除自由基和抑制炎癥反應(yīng)等）、繼發(fā)癥和并發(fā)癥的管理，以及后續(xù)的康復(fù)治療等。上述治療方案雖然不同程度緩解脊髓損傷的病理改變，延緩了慢性脊髓損傷患者整體結(jié)局，但對(duì)于嚴(yán)重的脊髓慢性損傷患者(AISA分級(jí)為A、B和C

3、級(jí))，上述方案所取得的療效相當(dāng)有限，僅靠解除壓迫、藥物治療及機(jī)體自身的能力無法完全修復(fù)脊髓不可逆性的損傷和恢復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。因此，尋求有效修復(fù)脊髓損傷的治療方法仍然是困擾臨床醫(yī)生的難題。
　　近年來，干細(xì)胞移植為慢性脊髓損傷的治療帶來新的思路，對(duì)于受壓脊髓局部病理生理環(huán)境改善和患者神經(jīng)功能恢復(fù)具有很大的潛力，是目前非常有前景的治療策略。脂肪干細(xì)胞(Adipose derived stem cells，ADSCs)是從脂肪組織中

4、分離得到的一種具有穩(wěn)定增殖和多向分化潛能的成體干細(xì)胞(Adult stem cells，ASCs)。脂肪儲(chǔ)存是可補(bǔ)充的、豐富的、可以大量獲取并對(duì)病人造成最小不適，吸脂手術(shù)與骨髓抽吸相比，脂肪干細(xì)胞分離創(chuàng)傷更小，更容易讓患者接受。吸脂及手術(shù)區(qū)域部分脂肪組織通常被認(rèn)為是醫(yī)學(xué)廢物最后丟棄，這是一個(gè)很好的自體ADSCs來源，逐漸成為再生醫(yī)學(xué)和組織工程研究熱點(diǎn)之一。研究表明，脂肪干細(xì)胞在特定的誘導(dǎo)條件下，具有分化成不同胚層來源細(xì)胞的潛能，如中胚層

5、來源的成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞，外胚層來源的神經(jīng)細(xì)胞、表皮細(xì)胞，內(nèi)胚層來源的肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、分泌胰島素的β樣細(xì)胞等。Safford等在2002年首次在含有丙戊酸、丁基羥基茴香醚、胰島素、氫化可的松的培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)第4-5代的脂肪干細(xì)胞向神經(jīng)元形態(tài)轉(zhuǎn)變，并表達(dá)神經(jīng)表型GFAP、Nestin和NeuN。最近研究表明脂肪干細(xì)胞在特定誘導(dǎo)條件下能夠形成神經(jīng)細(xì)胞譜系，因此構(gòu)建定向誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞形成神經(jīng)細(xì)胞譜系的培養(yǎng)體系對(duì)于慢性脊髓損傷的治療

6、具有非常重要的意義和潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。本研究的目的:分離、培養(yǎng)和鑒定大鼠ADSCs，并通過成骨和成脂誘導(dǎo)檢測其多能性;采用小分子化合物Dorsomorphin、CHIR99021、SB431542、維甲酸(Retinoic acid，RA)和丙戊酸鈉(Sodium Valproate，VPA)時(shí)序性調(diào)控ADSCs神經(jīng)分化的信號(hào)通路，建立誘導(dǎo)ADSCs形成神經(jīng)祖細(xì)胞(Neural progenitor cells，NPCs)的平面培養(yǎng)體

7、系，并進(jìn)一步誘導(dǎo)其形成神經(jīng)元樣細(xì)胞;建立慢性壓迫性脊髓損傷大鼠模型，并通過神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分和運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位檢測評(píng)估該模型;Ad-GFP腺病毒標(biāo)記的ADSCs和NPCs損傷部位原位移植，探究ADSCs及其分化的NPCs對(duì)慢性壓迫性脊髓損傷修復(fù)以及在體神經(jīng)分化。
　　研究方法：
　　(1)從大鼠附睪旁和腹股溝脂肪組織中利用酶消法分離ADSCs，體外擴(kuò)增培養(yǎng)ADSCs，細(xì)胞流式技術(shù)鑒定ADSCs的免疫表型CD29、CD90、CD3

8、4和CD11b;并使用成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（HG-DMEM培養(yǎng)基中添加10％FBS、0.1μM地塞米松、0.5μM抗壞血酸和10mMβ-甘油磷酸鈉）和成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基（HG-DMEM培養(yǎng)基中添加10％FBS、0.5mM IBMX、0.2mM吲哚美辛、0.1μM地塞米松和10μM胰島素）誘導(dǎo)ADSCs成骨和成脂分化，誘導(dǎo)21天后分別行茜素紅染色和油紅O染色，測定ADSCs的多能性。
　　(2)使用小分子化合物Dorsomorphin、CHI

9、R99021、SB431542、維甲酸(Retinoicacid，RA)和丙戊酸(Valproic acid，VPA)干預(yù)ADSCs神經(jīng)分化的信號(hào)通路，模擬神經(jīng)發(fā)育過程，構(gòu)建階段性誘導(dǎo)ADSCs階段性形成神經(jīng)細(xì)胞譜系的培養(yǎng)體系。ADSCs在第一誘導(dǎo)階段完全培養(yǎng)基(DMEM/F12(LG)中添加10％FBS、2μMDorsomorphin、3μM CHIR99021和2μM SB431542）中培養(yǎng)，采用細(xì)胞免疫熒光、western bl

10、ot和RT-PCR分別檢測DMSO對(duì)照組和誘導(dǎo)組各誘導(dǎo)時(shí)間段(誘導(dǎo)12h、24h、3d、3d和6d)神經(jīng)祖細(xì)胞(Neural progenitor cells，NPCs)標(biāo)志物Pax6和Sox1蛋白和mRNA的表達(dá)。隨后，第一誘導(dǎo)階段形成的NPCs在第二誘導(dǎo)階段完全培養(yǎng)基(DMEM/F12(LG)中添加10％FBS、2μM Dorsomorphin、1μMCHIR99021、2μM SB431542、0.1μM RA和0.5μM VPA

11、）中培養(yǎng)6天，采用細(xì)胞免疫熒光、western blot和RT-PCR檢測對(duì)照組和誘導(dǎo)組NeuroD1、ChAT蛋白和mRNA的表達(dá)。最后，在第二誘導(dǎo)階段形成的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元前體細(xì)胞(Motor neuronprecursor cells，MNPs)在第三誘導(dǎo)階段完全培養(yǎng)基(DMEM/F12(LG)中添加10％FBS、0.5μμM RA和0.5μM VPA）培養(yǎng)6天，采用細(xì)胞免疫熒光、western blot和RT-PCR檢測對(duì)照組和誘導(dǎo)組

12、ChAT、βⅢ-tubulin的表達(dá)。
　　(3)隨機(jī)將50只SD大鼠（雄性，180±20g）分為正常對(duì)照組(n=10)、假手術(shù)組(n=10)和慢性壓迫組(n=30)。改進(jìn)螺絲釘壓迫建模方法，設(shè)計(jì)一種簡便和易于操作的胸椎后路鈦金屬壓迫裝置，手術(shù)將壓迫裝置植入大鼠背部，使鈦壓迫墊片與T10段脊髓接觸。慢性壓迫組于術(shù)后24h、1w、2w、3w、4w、5w、6w將鈦螺絲擰入0.2mm，造成對(duì)脊髓的慢性持續(xù)性壓迫。假手術(shù)組只植入壓迫裝置，

13、不擰入鈦螺絲，其余與壓迫組一致。正常對(duì)照組不進(jìn)行手術(shù)操作，其余與假手術(shù)一致。分別于術(shù)前、術(shù)后24h、1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8w擰入鈦螺絲前行BBB評(píng)分。各組大鼠在術(shù)前和術(shù)后1w、2w、4w、6w和8w行經(jīng)顱電刺激運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位(Motor evoked potentials，MEP)檢測，計(jì)算MEP潛伏期和波幅。造模后4w和8w各組大鼠隨機(jī)選取5只，取受壓脊髓行病理學(xué)染色和βⅢ-tubulin免疫組化染色觀察脊髓病理變

14、化。
　　(4)采用1×108PFU/ml的Ad-GFP腺病毒轉(zhuǎn)染ADSCs和NPCs，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后24h，細(xì)胞計(jì)數(shù)，并用DMEM/F12重懸細(xì)胞，濃度為1×105/5ul。在慢性壓迫性脊髓損傷大鼠模型穩(wěn)定建立后8w，研究ADSCs和NPCs對(duì)慢性壓迫性脊髓損傷的修復(fù)效應(yīng)。將20只慢性壓迫性脊髓損傷大鼠隨機(jī)分為4組，壓迫對(duì)照組(n=5)大鼠不給于手術(shù)減壓和細(xì)胞移植;減壓+DMEM組(n=5)行手術(shù)減壓治療，并在損傷部位注射5ul D

15、MEM/F12作為對(duì)照;減壓+ADSCs組(n=5)行手術(shù)減壓和損傷部位注射ADSCs(1×105/5ul);減壓+NPCs組(n=5)行手術(shù)減壓和損傷部位注射NPCs(1×105/5ul)。分別在細(xì)胞移植前和細(xì)胞移植后24h、1w、2w、4w對(duì)各組大鼠行BBB評(píng)分，在移植后2w和4w行MEP檢測，評(píng)估神經(jīng)功能恢復(fù)情況。細(xì)胞移植后后4w各組大鼠脊髓組織取材，行GFP和βⅢ-tubulin免疫熒光染色，觀察各組大鼠神經(jīng)元存活和脊髓修復(fù)情況

16、，探究移植細(xì)胞的在體神經(jīng)分化。
　　研究結(jié)果：
　　(1)原代ADSCs在分離后培養(yǎng)的第9天細(xì)胞融合約90％左右，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣梭形、放射狀排列。傳代后3-5天細(xì)胞可增殖至90％左右。細(xì)胞流式分析ADSCs免疫表型結(jié)果:第3代ADSCs的CD29陽性率98.3％、CD90陽性率98.4％，而CD34陽性率為0.79％、CD11b陽性率為1.08％。ADSCs分別在成骨和成脂分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)21天后，成骨分化細(xì)胞可見典形的

17、礦化結(jié)節(jié)形成，并且被茜素紅染成橘紅色;成脂分化細(xì)胞油紅O染色顯示脂滴被染成大小不等的圓形，聚集在細(xì)胞邊緣。
　　(2)使用Dorsomorphin、CHIR99021、SB431542、RA和VPA階段性誘導(dǎo)ADSCs形成神經(jīng)細(xì)胞譜系，第一誘導(dǎo)階段培養(yǎng)2d、3d和6d，western blot和RT-PCR結(jié)果表明神經(jīng)祖細(xì)胞標(biāo)志物Sox1和Pax6蛋白和mRNA表達(dá)量顯著升高（與DMSO組相比，P＜0.01），并且在第3天達(dá)到最高

18、，細(xì)胞免疫熒光顯示在誘導(dǎo)的第3天，Sox1和Pax6陽性細(xì)胞比例大于90％。在第二誘導(dǎo)階段，NPCs誘導(dǎo)6天后，westernblot和RT-PCR結(jié)果表明早期神經(jīng)元標(biāo)志物NeuroD1和膽堿能神經(jīng)元標(biāo)志物ChAT蛋白和mRNA的表達(dá)量顯著升高（與對(duì)照組，P＜0.01），細(xì)胞免疫熒光顯示NeuroD1和ChAT陽性細(xì)胞比例大于90％。在第三誘導(dǎo)階段，MNPs誘導(dǎo)6天后，神經(jīng)元標(biāo)志物βⅢ-tubulin和ChAT的表達(dá)量顯著增加，細(xì)胞免疫

19、熒光顯示細(xì)胞向兩極形成長的突起，形態(tài)與運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元相似。
　　(3)在慢性壓迫性脊髓損傷建模后1w、2w、3w、4w、5w、6w和7w，BBB評(píng)分持續(xù)性下降（和假手術(shù)相比，P＜0.01），造模后7周以后BBB評(píng)分呈穩(wěn)定狀態(tài)。經(jīng)顱電刺激運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位檢測表明:MEP潛伏期逐漸延長，造模2w后潛伏期與假手術(shù)存在差異(P＜0.05); MEP波幅逐漸減低，造模4周后與假手術(shù)組存在差異(P＜0.05)。病理和免疫組化染色結(jié)果表明:模型組的脊髓

20、呈慢性損傷改變，隨壓迫時(shí)間延長，脊髓前角βⅢ-tubulin陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著減少（和假手術(shù)相比，P＜0.01）。
　　(4)Ad-GFP腺病毒轉(zhuǎn)染ADSCs和NPCs，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染24h后轉(zhuǎn)染率達(dá)到大于80％。細(xì)胞移植后BBB評(píng)分結(jié)果顯示:與壓迫對(duì)照組相比，減壓+DMEM組神經(jīng)功能行為學(xué)無明顯改善(P＞0.05);減壓+DMEM相比，減壓+ADSCs組在細(xì)胞移植后2周神經(jīng)功能行為學(xué)出現(xiàn)改善(P＜0.05)，在移植后4周明顯改善(P＜

21、0.01)，而減壓+NPCs組在移植后2周神經(jīng)功能行為學(xué)出現(xiàn)明顯改善(P＜0.01)。，減壓+ADSCs組(13.25±0.50)和減壓+NPCs組(14.25±0.96)在移植后4周存在差異(P＜0.05)。經(jīng)顱電刺激運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位結(jié)果顯示:和壓迫對(duì)照組相比，減壓+DMEM組和減壓+ADSCs組MEP潛伏期在減壓術(shù)后4周改善(P＜0.05)，而減壓+NPCs組MEP潛伏期明顯改善(P＜0.01)。減壓+ADSCs組和減壓+NPCs組無明

22、顯差異(P＞0.05)。MEP波幅變異大，不推薦作為評(píng)價(jià)神經(jīng)功能恢復(fù)的指標(biāo)。組織免疫熒光顯示:壓迫組脊髓前角βⅢ-tubulin陽性神經(jīng)元數(shù)量很少，神經(jīng)纖維排列紊亂，脊髓空洞明顯。與壓迫組相比，減壓+DMEM組和減壓+ADSCs組脊髓病理改變有改善，βⅢ-tubulin陽性神經(jīng)元數(shù)量存在差異(P＜0.05)。與減壓+DMEM組相比，減壓+NPCs組在細(xì)胞移植后4周，脊髓病理改變明顯改善，脊髓空洞被GFP陽性細(xì)胞填充，βⅢ-tubulin

23、陽性神經(jīng)元數(shù)量增加(P＜0.05)。減壓+ADSCs組和減壓+NPCs組都未檢測到GFP/βⅢ-tubulin雙陽性的細(xì)胞，兩組脊髓前角都存在較多GFP陽性細(xì)胞，且數(shù)量無差異(P＞0.05)。但減壓+NPCs組GFP陽性細(xì)胞體積較大，形態(tài)呈雙極狀。
　　研究結(jié)論：
　　(1)從大鼠脂肪中提取ADSCs，具有成體干細(xì)胞免疫表現(xiàn)，并能夠在體外穩(wěn)定增殖，并有成骨和成脂分化的潛能。
　　(2)小分子化合物Dorsomorphi

24、n、CHIR99021、SB431542、RA和VPA調(diào)控脂肪干細(xì)胞神經(jīng)分化的多條信號(hào)通路，模擬神經(jīng)發(fā)育過程，階段性誘導(dǎo)ADSCs向神經(jīng)細(xì)胞譜系轉(zhuǎn)分化，在第一誘導(dǎo)階段培養(yǎng)3天后ADSCs形成Pax6和Sox1陽性的神經(jīng)祖細(xì)胞(Neural progenitor cells，NPCs)，在第二誘導(dǎo)階段形成NeuroD1和ChAT陽性的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元前體細(xì)胞(Motor neuron precursor cells，MNPs)，分化比率大于90

25、％。在第三誘導(dǎo)階段培養(yǎng)6天后，形成ChAT和βⅢ-tubulin陽性的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元樣細(xì)胞，但還需細(xì)胞膜片鉗檢測是否具有神經(jīng)元膜電位特性。
　　(3)改進(jìn)螺絲釘壓迫法，設(shè)計(jì)慢性壓迫裝置，建立慢性壓迫性脊髓損傷大鼠模型，并通過神經(jīng)功能行為學(xué)評(píng)分和經(jīng)顱電刺激運(yùn)動(dòng)誘發(fā)電位檢測表明該模型符合慢性壓迫性脊髓損傷特點(diǎn)。
　　(4)減壓手術(shù)聯(lián)合ADSCs及其誘導(dǎo)形成的NPCs的移植，相比單純減壓手術(shù)，能夠更好地改善慢性壓迫性脊髓損傷大鼠神經(jīng)功