芍藥木瓜湯對慢性頸髓壓迫大鼠脊髓內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化過程中NT-3影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:通過雙重免疫熒光組織化學(xué)標(biāo)記方法及 Real-timePCR技術(shù)分別檢測脊髓 BrdU+、Nestin+內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的變化和 NT-3表達(dá)情況變化,來分析芍藥木瓜湯對脊髓慢性受壓后脊髓內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化過程中NT-3影響,分析影響內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的關(guān)鍵因素,闡明芍藥木瓜治療CSM的機(jī)理。
　　方法:月齡3~4個(gè)月 SD大鼠30只,雄性,SPF級,體重在0.3~0.4kg左右。隨機(jī)分為五組:正常組6只、假

2、手術(shù)組6只、模型對照組6只、低劑量治療組6只、高劑量治療組6只,每只動(dòng)物進(jìn)行編號。參照蔡欽林介[1]紹的動(dòng)物造模方法,經(jīng)第3、4頸椎椎椎間隙置入直徑2.5mm螺絲釘緩慢多次加壓建立脊髓慢性受壓動(dòng)物模型,術(shù)后在加熱床上恢復(fù)之后,將大鼠分籠飼養(yǎng),在籠中可自由活動(dòng)、獲取食物和水。手術(shù)造模6周后開始藥物干預(yù)。治療組給予芍藥木瓜湯灌胃,按人與大鼠等效劑量計(jì)算,低劑量治療組以每天每公斤體重11.5g/kg/d的劑量給藥,高劑量治療組以每天每公斤體重

3、23g/kg/d的劑量給藥,每日灌胃2次;另三組予以與正常劑量組等體積生理鹽水灌胃,每日1次。共治療4周。各組大鼠在處死前1周,開始腹腔注射BrdU,1次/天,最后一次注射后2h處死大鼠。各組治療4周后取材。使用水合氯醛(40mg/kg)過度麻醉大鼠,處死,通過升主動(dòng)脈灌注5ml無鈣緩沖液,之后用300ml福爾馬林苦味酸溶液(4％甲醛,0.4％苦味酸于0.16 mol/L磷酸鹽緩沖液,pH=7.4)灌注。完整取出頸椎,將脊髓從椎管中分離

4、出來,保存在4％磷酸鹽緩沖液甲醛溶液中。采用尼氏染色法和雙重免疫熒光組織化學(xué)標(biāo)記方法觀察治療后單位神經(jīng)元數(shù)目和 BrdU+/Nestin+神經(jīng)元的變化;采用免疫組化和 Real-timePCR技術(shù)檢測治療前后神經(jīng)營養(yǎng)因子-3的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:(1)病理學(xué)肉眼所見:正常組、假手術(shù)組脊髓呈圓柱形,顏色正常,未發(fā)生扁平化;高劑量組、低劑量組脊髓出現(xiàn)了扁平化,橫徑增大,矢狀徑減小,部分動(dòng)物脊髓背側(cè)可見一明顯的凹陷。(2)光鏡下正常組

5、、假手術(shù)組脊髓灰質(zhì)和白質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰、完整,灰質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞呈多角形,突起明顯,胞漿豐富,尼氏小體豐富、清晰可見,細(xì)胞核呈圓形,居中,核仁明顯。白質(zhì)神經(jīng)纖維排列緊密、整齊,軸突、髓鞘結(jié)構(gòu)清晰;高劑量組:脊髓灰質(zhì)內(nèi)神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較正常組和假手術(shù)組減少,部分神經(jīng)元細(xì)胞變性、壞死,表現(xiàn)為細(xì)胞體積變小、變圓,胞漿濃縮、染色加深,胞漿內(nèi)尼氏小體溶解、消失,細(xì)胞核體積變小、染色加深,核仁消失,膠質(zhì)細(xì)胞增生;白質(zhì)內(nèi)見少量小灶狀脫髓鞘區(qū);低劑量組:脊髓灰質(zhì)內(nèi)

6、神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量較正常組和假手術(shù)組減少,也比高劑量組的細(xì)胞數(shù)量少,神經(jīng)元細(xì)胞變性、壞死比高劑量組明顯,表現(xiàn)為細(xì)胞體積變小、變圓,胞漿濃縮、染色加深,胞漿內(nèi)尼氏小體溶解、消失,細(xì)胞核體積變小、染色加深,核仁消失,膠質(zhì)細(xì)胞增生不如高劑量組明顯;白質(zhì)內(nèi)見少量小灶狀脫髓鞘區(qū)。(3)免疫組化 BrdU:陽性部位定位于細(xì)胞核,損傷后治療組主要是脊髓灰質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)增多。Nestin:陽性部位定位于細(xì)胞漿,損傷后治療組神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)增多。NT-3

7、:陽性部位定位于神經(jīng)元的細(xì)胞漿和細(xì)胞核,損傷后治療組神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)增多。
　　結(jié)論:(1)本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)造模方法參照蔡欽林介紹的動(dòng)物造模方法,經(jīng)第3、4頸椎椎椎間隙置入直徑1.5mm螺絲釘緩慢多次加壓建立脊髓慢性受壓動(dòng)物模型,此次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)造模成功再次證明這種造模方法具有成功率高,穩(wěn)定性好,誘導(dǎo)周期短,重復(fù)性好的優(yōu)點(diǎn)。(2)通過對實(shí)驗(yàn)觀察芍藥木瓜湯治療后 BrdU+陽性部位定位于細(xì)胞核,損傷后治療組脊髓灰質(zhì)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)增多。(3