局灶性腦缺血后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：通過(guò)建立大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，觀察膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(GDNF)對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦室下區(qū)(SVZ)、齒狀回(DG)、皮質(zhì)和尾殼核神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)增殖分化的影響，以及相關(guān)區(qū)域nNOS陽(yáng)性神經(jīng)元分布規(guī)律的變化，探討GDNF和NO對(duì)內(nèi)源性NSCs增殖分化的作用機(jī)制。材料與方法：大腦中動(dòng)脈線栓法制作大鼠右側(cè)局灶性腦缺血再灌注模型，按ZeaLonga五級(jí)四分法評(píng)定動(dòng)物神經(jīng)病學(xué)體征，將第1、2、3級(jí)大鼠確定為成功模型

2、。中樞立體定位下左側(cè)腦室注射GDNF，應(yīng)用5-溴脫氧尿核苷(BrdU)標(biāo)記DNA合成期(S期)細(xì)胞即增殖細(xì)胞，同時(shí)應(yīng)用Y迷宮監(jiān)測(cè)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力。采用磁共振成像(MRI)檢查追蹤大鼠腦部影像學(xué)變化。免疫組化單標(biāo)、雙標(biāo)法觀察正常組、假手術(shù)組、模型組、生理鹽水組和GDNF組大鼠局灶性腦缺血90min后再灌注不同時(shí)間(分別為3d、7d、14d、21d、28d)SVZ、DG、皮質(zhì)和尾殼核BrdU、nNOS單標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞、BrdU/Nestin、B

3、rdU/nNOS、BrdU/NeuN、BrdU/GFAP雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)情況；統(tǒng)計(jì)相關(guān)區(qū)域的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，利用組間差異比較的方差分析、t檢驗(yàn)，比較各組大鼠SVZ、DG、皮質(zhì)和尾殼核細(xì)胞增殖分化和nNOS表達(dá)的差異，分析GDNF和NO與腦缺血后相關(guān)腦區(qū)細(xì)胞增殖和分化的關(guān)系。 結(jié)果：1.模型組、生理鹽水組和GDNF組大鼠都出現(xiàn)不同程度左側(cè)肢體偏癱。HE染色：模型組、生理鹽水組大鼠缺血再灌注后3d，缺血側(cè)尾殼核外側(cè)可見(jiàn)缺血壞死區(qū)，隨缺

4、血時(shí)間的延長(zhǎng)，壞死區(qū)面積逐步增大，至缺血后期，壞死灶進(jìn)一步擴(kuò)大，除尾殼核外，頂顳葉皮質(zhì)也出現(xiàn)明顯液化、壞死區(qū)；GDNF組大鼠缺血后3d，尾殼核缺血中心區(qū)出現(xiàn)散在分布?jí)乃涝睿?4d后，壞死灶逐漸縮小，尾殼核外和頂顳葉皮質(zhì)出現(xiàn)小量液化、壞死。 2.大鼠局灶性腦缺血造模后，MRI檢查T(mén)2WI上右側(cè)皮質(zhì)和尾殼核明顯信號(hào)增高，輕微腦腫脹和中線結(jié)構(gòu)移位，而T1WI上相應(yīng)腦區(qū)呈等信號(hào)，證實(shí)為腦缺血灶。在T2WI上動(dòng)態(tài)觀察大鼠腦部缺血灶形態(tài)和大

5、小變化，模型組大鼠缺血后3d，右側(cè)半球皮質(zhì)和尾殼核廣泛信號(hào)增高影，隨缺血時(shí)間延長(zhǎng)信號(hào)增高影面積逐漸縮小，呈片狀分布；GDNF組大鼠缺血后3d，右側(cè)半球皮質(zhì)和尾殼核出現(xiàn)小面積信號(hào)增高影，14d后信號(hào)增高影呈灶狀分布，強(qiáng)度明顯下降。 3.局灶性腦缺血再灌注對(duì)學(xué)習(xí)記憶損害明顯，但隨著再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)其有一定程度恢復(fù)；GDNF組大鼠學(xué)習(xí)記憶能力較模型組和生理鹽水組恢復(fù)明顯。 4.局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞增殖增加，在

6、SVZ、DG、皮質(zhì)和尾殼核等腦區(qū)BrdU/Nestin陽(yáng)性細(xì)胞在再灌注后3d增加，28d后明顯減少。BrdU/Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與正常組和假手術(shù)組比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)；GDNF組大鼠神經(jīng)前體細(xì)胞增殖明顯增加，BrdU/Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與正常組、假手術(shù)組、模型組和生理鹽水組比較，差異均有顯著性意義(P＜0.05)。 5.模型組和生理鹽水組大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后3d，DG、皮質(zhì)和尾殼核nNOS表達(dá)增

7、強(qiáng)，28d達(dá)高峰，BrdU/nNOS雙標(biāo)細(xì)胞在14d達(dá)高峰；nNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與正常組和假手術(shù)組比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)；BrdU/nNOS雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與正常組和假手術(shù)組比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)；GDNF組大鼠缺血前期nNOS表達(dá)水平明顯下降，nNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與其他各組比較，差異有顯著性意義(P＜0.05)；缺血后期nNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)逐漸增加，28d達(dá)高峰，BrdU/nNOS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)在缺血后21d達(dá)高峰

8、。 6.增殖細(xì)胞定向分化研究結(jié)果顯示：模型組、生理鹽水組和GDNF組大鼠SVZ、DG、皮質(zhì)和尾殼核腦區(qū)有大量的BrdU/NeuN和BrdU/nNOS雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞和部分BrdU/GFAP雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞，其中GDNF組BrdU/NeuN(58.23±15.30％)和BrdU/nNOS(36.44±8.33％)雙標(biāo)陽(yáng)性細(xì)胞率與正常組、假手術(shù)組、模型組和生理鹽水組相比差異有顯著性意義(P＜0.05)。 結(jié)論：1.局灶性腦缺血激活大