新生SD大鼠實(shí)驗(yàn)性缺氧缺血腦組織內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖及BRCA1基因的調(diào)控作用研究.pdf

1、第一部分新生鼠缺氧缺血性腦損傷動(dòng)物模型的建立和內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)變化的時(shí)空性研究 目的：建立新生鼠缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemie brain damage，HIBD)動(dòng)物模型。研究內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)在新生鼠生理狀態(tài)下表達(dá)的時(shí)空性變化和缺氧缺血性腦損傷時(shí)的激活增殖情況。 方法：采用SPF級(jí)，11—15克體重的7日齡新生SD大鼠做研究對(duì)象。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為H

2、IBD組和假手術(shù)對(duì)照組，每組8只。取HIBD后12h,1d,3d,7d和14d為觀察點(diǎn)。經(jīng)雙線結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈及8％氧氣的低氧處理2h，建立缺氧缺血性腦損傷動(dòng)物模型，光鏡和電鏡做病理學(xué)檢驗(yàn)觀察病變。用免疫熒光法檢測(cè)對(duì)照組和HIBD后巢蛋白(nestin)的表達(dá)變化。 結(jié)果：①HIBD后12—24h，神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)腫脹變性；HIBD后3d，細(xì)胞排列更加紊亂，出現(xiàn)核固縮、細(xì)胞濃染。HIBD后1d電鏡下細(xì)胞突觸減少，線粒體腫脹。②.對(duì)

3、照組在熒光顯微鏡下見到側(cè)腦室和海馬區(qū)出現(xiàn)胞漿綠色熒光，為異硫氰酸熒光素(F1uorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的nestin。側(cè)腦室區(qū)nestin熒光強(qiáng)度之間兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。海馬區(qū)nestin熒光強(qiáng)度之間兩兩比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。各時(shí)間點(diǎn)側(cè)腦室和海馬區(qū)熒光強(qiáng)度比較，側(cè)腦室區(qū)高于海馬區(qū)(P<0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。③．HIBD后與對(duì)照組比較，nestin熒光

4、強(qiáng)度1d開始升高，3d明顯升高，7d、14d逐漸下降，P均<0.05。HIBD后各時(shí)間點(diǎn)側(cè)腦室和海馬區(qū)nestin熒光強(qiáng)度比較，P均<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：①將7日齡SD大鼠經(jīng)單側(cè)頸總動(dòng)脈結(jié)扎及8％低氧處理，可以成功建立HIBD模型。②生理狀態(tài)下，腦組織有神經(jīng)干細(xì)胞存在，以側(cè)腦室和海馬區(qū)為主，側(cè)腦室神經(jīng)干細(xì)胞相對(duì)集中；神經(jīng)干細(xì)胞處于穩(wěn)定表達(dá)狀態(tài)。③HIBD可激活內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞表達(dá)，損傷后3d明顯。 第二部

5、分新生鼠實(shí)驗(yàn)性缺氧缺血腦組織BRCAlmRNA和BRCAl蛋白表達(dá)及意義 目的：觀察乳腺癌易感基因(breast cancer suscepfibility gene，BRCAl)mRNA和BRCAl蛋白在HIBD后腦組織中的表達(dá)變化，探討其意義。 方法：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)BRCAlmRNA在對(duì)照組和HIBD后腦組織中的表達(dá)；采用免疫印跡法(Westem Blot)檢測(cè)BRCAl蛋白在對(duì)照組和HIBD后腦組織中

6、的表達(dá)。 結(jié)果：①HIBD新生鼠腦中BRCAlmRNA表達(dá)與對(duì)照組相比，12h開始升高，1d明顯升高，3d、7d逐漸下降，P均<0.05。②BRCAl蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較，在HIBD后12h-24h開始升高，3d明顯升高，7d逐漸下降，P均<0.05。 結(jié)論：①HIBD新生SD大鼠腦組織中BRCAlmRNA和BRCAl蛋白均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。②新生SD大鼠腦組織在生理和HIBD后，均有神經(jīng)干細(xì)胞和BRCAl基因和蛋

7、白的表達(dá)，損傷后表達(dá)增高。三者變化趨勢(shì)一致。 第三部分雌激素干預(yù)BRCAl基因表達(dá)對(duì)新生SD大鼠實(shí)驗(yàn)性缺氧缺血神經(jīng)干細(xì)胞增殖影響的研究 目的：觀察雌激素(17 β-estradiol，17β-E2)干預(yù)BRCAlmRNA表達(dá)后，內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞增殖的變化情況，初步探討B(tài)RCAl基因與神經(jīng)干細(xì)胞增殖的關(guān)系。 方法：取HIBD后3d為觀察點(diǎn)。新生鼠分為6組：假手術(shù)對(duì)照組、單純HIBD組、使用橄欖油的空白對(duì)照組、使用低

8、濃度E2組、使用中濃度E2組、使用高濃度E2組。雌激素干預(yù)組每天給予頸部皮下注射雌激素一次，共3d。用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)BRCAl mRNA表達(dá)。5-溴脫氧尿苷嘧啶(bromodeoxyuridine，Brdu)是胸腺嘧啶脫氧核酸類似物，可在有絲分裂的S期摻入DNA的合成，故常用Brdu陽性來檢測(cè)細(xì)胞的增殖。為同時(shí)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖變化情況，給試驗(yàn)動(dòng)物腹腔注射Brdu(50mg／kg，每天2次，共3天)，用免疫熒光法檢測(cè)海馬區(qū)B

9、rdu陽性細(xì)胞數(shù)了解海馬區(qū)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖變化。對(duì)BRCAlmRNA與神經(jīng)干細(xì)胞增殖之間的關(guān)系做相關(guān)性分析。 結(jié)果：①隨著使用雌激素濃度升高，BRCAl mRNA表達(dá)升高，使用高濃度E2組BRCAl mRNA表達(dá)最高。各組間比較P均<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。②海馬區(qū)熒光素羅丹明(Rhodamine)標(biāo)記的呈紅色熒光的Brdu陽性細(xì)胞數(shù)在使用雌激素后增多，以使用高濃度E2組明顯。各組間比較P均<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。⑧經(jīng)