小鼠胚胎干細(xì)胞來(lái)源的c-kit+-SSEA1-細(xì)胞向視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分化的初步研究.pdf

1、目的:
　　視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa，RP)是視網(wǎng)膜光感受細(xì)胞和視網(wǎng)膜色素上皮變性引起的致盲性、遺傳性眼病，目前尚無(wú)治愈方法。干細(xì)胞移植是治療RP的最具前景的治療手段。其中胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)是一類(lèi)具有無(wú)限擴(kuò)增和多向分化潛能的干細(xì)胞，其中人胚胎干細(xì)胞來(lái)源的網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinalpigment epithelium，RPE)細(xì)胞已經(jīng)成功用于干性老年

2、黃斑變性和Stargart病的Ⅰ/Ⅱ期臨床治療，初步證實(shí)其在治療視網(wǎng)膜色素變性疾病中的安全性和有效性。
　　視網(wǎng)膜祖細(xì)胞(retinal progenitor cells，RPCs)是眼早期發(fā)育階段中具備分化為6種視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞、RPE和1種膠質(zhì)細(xì)胞能力的多能性干細(xì)胞，它可由ESCs體外誘導(dǎo)分化形成。c-kit是一種干細(xì)胞因子受體，已有研究表明，從器官來(lái)源的c-kit陽(yáng)性細(xì)胞具有自我更新和多分化潛能。由于c-kit是一種細(xì)胞膜抗原

3、，可以通過(guò)流式細(xì)胞儀分離純化c-kit陽(yáng)性細(xì)胞。同時(shí)，已有研究發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層亦存在c-kit陽(yáng)性細(xì)胞，且其表達(dá)高峰集中在視網(wǎng)膜祖細(xì)胞的較成熟階段。本研究將c-kit和ESCs標(biāo)記物SSEA1(stage-specific embryonic antigen1，SSEA1)結(jié)合，推測(cè)在ESCs向視網(wǎng)膜終末細(xì)胞分化的過(guò)程中c-kit+/SSEA1-細(xì)胞群代表發(fā)育較成熟的視網(wǎng)膜祖細(xì)胞，且細(xì)胞成瘤風(fēng)險(xiǎn)很低。從ESCs的分化細(xì)胞中篩選出c-

4、kit+/SSEA1-細(xì)胞，有進(jìn)一步將其向RPE細(xì)胞分化的能力。
　　RPE細(xì)胞層位于視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層之間，它具有特殊的結(jié)構(gòu)和生理機(jī)能。在脊椎動(dòng)物，RPE來(lái)源于視杯的神經(jīng)外胚葉外層，經(jīng)過(guò)一系列誘導(dǎo)作用和時(shí)間、空間上的協(xié)調(diào)，形成成熟的RPE細(xì)胞，是體內(nèi)最早產(chǎn)生黑色素的細(xì)胞。在視泡早期，視覺(jué)神經(jīng)上皮的發(fā)育主要受多種細(xì)胞外轉(zhuǎn)錄因子和眼外間葉細(xì)胞分泌因子的影響，包括轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β超家族（transforming grow

5、th factorβfamily，TGF-β）中的骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）和活化素A(activin A)以及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factors，F(xiàn)GFs）等。目前，將ESCs體外誘導(dǎo)分化成RPE細(xì)胞的研究已經(jīng)取得了重要進(jìn)展，誘導(dǎo)方法主要分為兩種:第一，采用PA6間充質(zhì)細(xì)胞系作為飼養(yǎng)細(xì)胞層，在無(wú)bFGF培養(yǎng)基條件下誘導(dǎo)出RPE細(xì)胞并進(jìn)一步擴(kuò)增;第二

6、，采用ESCs懸浮培養(yǎng)形成擬胚體（embryonic bodies，EBs），再將EBs在層黏連蛋白和纖維連接蛋白或者明膠處理過(guò)的培養(yǎng)皿上貼壁培養(yǎng)后得到RPE細(xì)胞。第1種方法誘導(dǎo)效率低、誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)，本研究采用同第2種方法相似的誘導(dǎo)方法。
　　本課題的研究日的在于初步探索mESCs來(lái)源的c-kit+/SSEA1-視網(wǎng)膜祖細(xì)胞體外向RPE細(xì)胞分化的方法及效率，為由視網(wǎng)膜色素上皮變性引起的致盲性眼病的細(xì)胞移植尋求新的治療細(xì)胞。
　

7、　方法:
　　第一部分:小鼠胚胎干細(xì)胞來(lái)源的c-kit+/SSEA1-細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
　　1.小鼠胚胎干細(xì)胞株AB1進(jìn)行傳代培養(yǎng)。干細(xì)胞標(biāo)記物SSEA1鑒定傳21代、26代和31代的mESCs。
　　2.用懸浮培養(yǎng)添加誘導(dǎo)因子形成EBs的方法誘導(dǎo)mESCs向視網(wǎng)膜祖細(xì)胞分化，免疫熒光染色鑒定分化第9天細(xì)胞中c-kit標(biāo)記物的表達(dá)情況。
　　3.用流式細(xì)胞分選儀分選出分化第9天細(xì)胞中的c-kit+/SSEA1-細(xì)

8、胞群，免疫熒光染色鑒定分選后細(xì)胞中視網(wǎng)膜祖細(xì)胞標(biāo)記物Nestin、Pax6和c-kit的表達(dá)情況。
　　第二部分:小鼠胚胎干細(xì)胞來(lái)源的c-kit+/SSEA1-細(xì)胞向視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的分化及鑒定
　　1.用貼壁培養(yǎng)的方法誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞來(lái)源的c-kit+/SSEA1-細(xì)胞向視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分化。
　　2.收集分化第0天、第10天和第40天的細(xì)胞，流式細(xì)胞儀鑒定視網(wǎng)膜色素上皮前體細(xì)胞標(biāo)記物Mitf、 Pax6的表達(dá)

9、情況。
　　3.收集分化第0天、第10天和第40天的細(xì)胞，免疫熒光染色鑒定分化第40天視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞成熟標(biāo)記物Bestrophin的表達(dá)情況，流式細(xì)胞儀鑒定視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞成熟標(biāo)記物Bestrophin、CRALBP和RPE65的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　第一部分:小鼠胚胎干細(xì)胞來(lái)源的c-kit+/SSEA1-細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定
　　1.傳21代、26代和31代的mESCs均陽(yáng)性表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物SSEA

10、1。傳代P21的mESCs細(xì)胞群中SSEA1比例為（80.3±4.9）％;P26的mESCs細(xì)胞群中SSEA1陽(yáng)性細(xì)胞比例為（74.9±1.1）％;P31的mESCs細(xì)胞群中SSEA1陽(yáng)性細(xì)胞比例為（72.4±2.3）％。
　　2.在懸浮培養(yǎng)添加誘導(dǎo)因子的培養(yǎng)條件下mESCs在分化第一天形成懸浮的EBs，隨著培養(yǎng)天數(shù)增加球體體積逐漸增大，于分化第9天檢測(cè)分化的部分細(xì)胞c-kit陽(yáng)性表達(dá)。
　　3.分選出的分化第9天細(xì)胞中的c

11、-kit+/SSEA1-細(xì)胞群貼壁分化，c-kit+/SSEA1-細(xì)胞群陽(yáng)性表達(dá)Nestin、Pax6、Ki67和c-kit。
　　第二部分:小鼠胚胎干細(xì)胞來(lái)源的c-kit+/SSEA1-細(xì)胞向視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的分化及鑒定
　　1.mESCs來(lái)源的c-kit+/SSEA1-細(xì)胞向RPE分化第25天觀察到“鋪路石”樣細(xì)胞形態(tài)，胞體中可見(jiàn)黑色色素顆粒沉積。
　　2.分化前第0天mESCs細(xì)胞中Mitf比例為（1.7±1.

12、5）％，Pax6比例為(6.5±0.2)％;分化第10天，培養(yǎng)體系中Mitf陽(yáng)性細(xì)胞比例為（28.5±7.2）％，Pax6陽(yáng)性細(xì)胞比例為（60.2±15.6）％;分化第40天，培養(yǎng)體系中Mitf陽(yáng)性細(xì)胞比例為（5.7±2.1）％，Pax6陽(yáng)性細(xì)胞比例為（4.6±0.6）％。
　　3.分化前第0天mESCs細(xì)胞中Bestrophin陽(yáng)性細(xì)胞比例為（1.2±0.2）％，CRALBP陽(yáng)性細(xì)胞比例為（2.3±0.3）％，RPE65陽(yáng)性細(xì)胞

13、比例為（1.3±0.1）％;分化第10天培養(yǎng)體系中Bestrophin陽(yáng)性細(xì)胞比例為（45.5±1.2）％，CRALBP陽(yáng)性細(xì)胞比例為（6.0±0.1）％，RPE65陽(yáng)性細(xì)胞比例為（4.3±2.2）％;分化第40天培養(yǎng)體系中Bestrophin陽(yáng)性細(xì)胞比例為（61.6±2.4）％，CRALBP陽(yáng)性細(xì)胞比例為（31.0±3.9）％，RPE65陽(yáng)性細(xì)胞比例為（57.8±2.0）％。
　　結(jié)論:
　　本課題研究了mESCs向RPC