聯(lián)合共培養(yǎng)系統(tǒng)誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞研究.pdf

1、目的：探討添加腦源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子(brain—derired neurotrophic factorBDNF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor bFGF)培養(yǎng)基聯(lián)合人類視網(wǎng)膜色素上皮(human retinal pigment epithe-lialium,HRPE)細(xì)胞共培養(yǎng)對(duì)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞(bone marr

2、ow stromal cells.BMSCs)定向誘導(dǎo)分化的影響。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)分3組:HRPE+BDNF、EGF、bFGF+BMSCs共培養(yǎng)組、BDNF、EGF、bFGF+BMSCs共培養(yǎng)組,和對(duì)照組(單獨(dú)BMSCs)。體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(HRPE)和大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),取第3代HRPE和第3代BMSCs接種于Transwell雙層培養(yǎng)板內(nèi)共培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化,采用免疫細(xì)胞化學(xué)

3、染色、RT—PCR檢測(cè)角蛋白18、RPE65蛋白在誘導(dǎo)細(xì)胞中的表達(dá)。隨后把誘導(dǎo)后細(xì)胞和人視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞再次共培養(yǎng)2d,第二天倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞吞噬現(xiàn)象,采用RT—PCR檢測(cè)光感受器特異性標(biāo)志視紫紅質(zhì)(Rhodopsin)在誘導(dǎo)細(xì)胞中的表達(dá),單獨(dú)培養(yǎng)誘導(dǎo)后細(xì)胞檢測(cè)上清液中PEDF水平。
　　 結(jié)果：共培養(yǎng)2 w后的細(xì)胞置倒置相差顯微鏡下觀察:HRPE+BDNF、EGF、bFGF+BMSCs共培養(yǎng)組在誘導(dǎo)14 d后,BMS

4、Cs出現(xiàn)明顯胞體由原來(lái)的纖維細(xì)胞外觀變?yōu)閳A形、橢圓形,胞漿內(nèi)出現(xiàn)色素顆粒。出現(xiàn)類似RPE細(xì)胞樣外觀。而另外兩組分化細(xì)胞明顯較少,胞體基本沒(méi)有變化,胞漿內(nèi)也未見(jiàn)色素顆粒樣改變；免疫細(xì)胞化學(xué)染色顯示:HRPE+BDNF、EGF、bFGF+BMSCs共培養(yǎng)組能誘導(dǎo)BMSCs更多的表達(dá)角蛋白18(OD:0.527±0.029)、RPE65(OD:0.326±0.019)。將三種培養(yǎng)條件下所表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

5、角蛋白18:t=38.611、37.532、P<0.05; RPE65:t=37.416、36.236、P<0.05)。RT—PCR的鑒定結(jié)果顯示同樣結(jié)果。對(duì)誘導(dǎo)后的細(xì)胞吞噬功能和分泌PEDF功能檢測(cè)顯示誘導(dǎo)后的可以吞噬感光細(xì)胞脫落的外節(jié)膜盤結(jié)構(gòu)。單獨(dú)培養(yǎng)誘導(dǎo)后的細(xì)胞上清液中可以檢測(cè)到PEDF陽(yáng)性。
　　 結(jié)論：HRPE+BDNF、EGF、bFGF+BMSCs共培養(yǎng)可以誘導(dǎo)BMSCs向視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞分化。人BMSCs細(xì)胞在和