槌果藤乙醇提取物對(duì)進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥患者成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原產(chǎn)生的影響及其作用機(jī)理研究.pdf

1、[研究背景] 進(jìn)行性系統(tǒng)性硬化癥(PSS)是以局限性或彌漫性皮膚和內(nèi)臟器官結(jié)締組織的纖維化或硬化，最后導(dǎo)致功能障礙為特點(diǎn)的疾病，PSS患者的成纖維細(xì)胞胞外基質(zhì)(ECM)合成增加是皮膚、內(nèi)臟纖維硬化的主要原因之一，其中尤以Ⅰ型膠原增多顯著。TGF-β、CTGF是主要的促纖維化細(xì)胞因子，在PSS中表達(dá)增高，通過(guò)促進(jìn)膠原等基質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄及合成參與PSS的發(fā)病。分解減少是PSS患者ECM堆積的另一重要原因，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)及其

2、抑制劑金屬蛋白酶組織抑制物(TIMPs)是關(guān)鍵的ECM降解酶體系，TIMPs與活化狀態(tài)的MMPs以1:1克分子比例非共價(jià)結(jié)合，抑制MMPs的活性。其中MMP-1、MMP-3及TIMP-1、TIMP-3與PSS患者發(fā)病關(guān)系密切，PSS患者TIMP-1，3產(chǎn)生增加，MMP-1，3合成減少、活性降低導(dǎo)致ECM降解減少。近年來(lái)研究表明氧化應(yīng)激參與硬皮病的發(fā)病，PSS患者的單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞產(chǎn)生02-、H2O2水平顯著高于正常人，細(xì)胞內(nèi)活性氧(

3、ROS)水平明顯增加，增高的ROSS僅可通過(guò)ROS—ERK1／2-Ha-Ras信號(hào)鏈，而且可通過(guò)誘導(dǎo)TGF-β1、CTGFmRNA表達(dá)和活化促進(jìn)膠原等基質(zhì)基因表達(dá)，并且可誘導(dǎo)PAI、TIMP-3合成，減少基質(zhì)降解。 槌果藤在新疆作為一種民族藥而被廣泛應(yīng)用，化學(xué)研究表明：槌果藤中含有揮發(fā)油(異硫氰酸酯、麝香草酚、棕櫚酸等)、吲哚類、類黃酮類、谷甾醇類、葡萄糖異硫氰酸鹽及一些結(jié)構(gòu)新穎的化合物，藥理學(xué)研究表明，槌果藤具有抗菌、抗炎、抗

4、氧化、保肝、降血脂血糖等作用，其中抗氧化作用尤其引人矚目。曾有報(bào)道用槌果藤鮮果泥膏外敷治療局限性硬皮病，療效顯著，但局部刺激反應(yīng)明顯，并缺乏藥理、作用機(jī)理方面的研究報(bào)道。研究槌果藤乙醇提取物對(duì)PSS患者成纖維細(xì)胞膠原產(chǎn)生的影響及作用機(jī)理探討有助于該藥的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用。 [目的] 明確槌果藤乙醇提取物對(duì)PSS患者成纖維細(xì)胞增殖、I型膠原mRNA表達(dá)、蛋白合成的影響，通過(guò)研究槌果藤乙醇提取物對(duì)PSS患者成纖維細(xì)胞TGF-β1

5、、CTGF，ECM降解酶體系(MMP-1，3、TIMP-1，3)及活性氧水平的影響探討該提取物是否通過(guò)抑制促纖維化細(xì)胞因子表達(dá)、促進(jìn)降解或抗氧化應(yīng)激而發(fā)揮其抗纖維化作用。并排除該提取物的細(xì)胞毒性。 [方法] 第一部分：正常人、PSS患者成纖維細(xì)胞的分離、原代培養(yǎng)，提取總RNA和蛋白質(zhì)。以MTT法檢測(cè)槌果藤乙醇提取物對(duì)PSS患者成纖維細(xì)胞增殖的影響；以AnnexinV-FITC／PI染色用流式細(xì)胞儀檢測(cè)該提取物對(duì)PSS患者

6、成纖維細(xì)胞凋亡的影響；以逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcript polymerase chain reaction, RT-PCR)檢測(cè)該提取物對(duì)PSS患者成纖維細(xì)胞I型膠原mRNA表達(dá)的影響；以Western-blot法檢測(cè)該提取物對(duì)PSS患者成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白合成的影響。 第二部分：以逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcript polymerase chain reaction，RT-

7、PCR)檢測(cè)該提取物對(duì)PSS患者成纖維細(xì)胞TGF-β1、CTGF、ECM降解酶體系(MMP-1，3、TIMP-1，3)mRNA表達(dá)的影響；以免疫熒光法、Western-blot法檢測(cè)該提取物對(duì)PSS患者成纖維細(xì)胞TGF-β1、CTGF蛋白表達(dá)的影響。 第三部分：用細(xì)胞色素C還原法檢測(cè)該提取物對(duì)PSS患者成纖維細(xì)胞超氧陰離子產(chǎn)生的影響；用高香草酸一辣根過(guò)氧化酶法檢測(cè)該提取物對(duì)PSS患者成纖維細(xì)胞過(guò)氧化氫產(chǎn)生的影響；用DCFH-DA

8、熒光探針經(jīng)熒光纖維鏡觀察、流式細(xì)胞儀檢測(cè)該提取物對(duì)PSS患者成纖維細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響；以AnnexinV-FITC／PI染色用流式細(xì)胞儀檢測(cè)該提取物對(duì)H2O2誘導(dǎo)PSS患者成纖維細(xì)胞凋亡的保護(hù)作用。 [結(jié)果] 一、槌果藤乙醇提取物劑量依賴性地抑制PSS患者成纖維細(xì)胞的增殖，對(duì)正常人成纖維細(xì)胞的增殖無(wú)影響，加藥后與未加藥的成纖維細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯差異，凋亡、死亡細(xì)胞無(wú)明顯增多。 二、槌果藤提取物可顯著抑制PSS患者

9、成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)，并呈時(shí)間和劑量依賴性；可劑量依賴性地抑制PSS患者成纖維細(xì)胞Ⅰ型膠原蛋白的合成。 三、槌果藤提取物可顯著抑制PSS患者成纖維細(xì)胞CTGFmRNA表達(dá)，并呈時(shí)間和劑量依賴性；可劑量依賴性地抑制PSS患者成纖維細(xì)胞CTGF蛋白的表達(dá)。對(duì)TGF-βmRNA表達(dá)、蛋白合成無(wú)影響。 四、槌果藤提取物可上調(diào)PSS患者成纖維細(xì)胞MMP-1、抑制TIMP-3 mRNA表達(dá)，并呈時(shí)間和劑量依賴性。

10、五、槌果藤提取物可劑量依賴性地抑制PSS患者成纖維細(xì)胞O2-、H2O2的產(chǎn)生，劑量依賴性地降低PSS患者成纖維細(xì)胞內(nèi)ROS的水平。 六、槌果藤提取物可顯著降低H2Oz誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞凋亡。 [結(jié)論] 一、槌果藤乙醇提取物通過(guò)抑制PSS患者成纖維細(xì)胞增殖、Ⅰ型膠原基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成而發(fā)揮抗皮膚纖維化作用。該提取物在100 μg ml-1無(wú)明顯細(xì)胞毒性。 二、槌果藤提取物通過(guò)抑制PSS患者成纖維細(xì)胞CTGFm