系統(tǒng)性硬皮病患者成纖維細(xì)胞高膠原合成克隆膠原基因轉(zhuǎn)錄特性與調(diào)控研究.pdf

1、第一部分SSc患者和正常人皮膚Fb克隆分離及膠原合成異質(zhì)性克隆的篩選
　　 目的：分離系統(tǒng)性硬皮病(Systemicscleroderma,SSc)患者和正常人皮膚成纖維細(xì)胞(Fibroblast,Fb)克隆,篩選出膠原合成異質(zhì)性克隆。
　　 方法：以組織塊培養(yǎng)法進(jìn)行SSc患者和正常人皮膚Fb原代培養(yǎng),采用免疫組化方法進(jìn)行細(xì)胞鑒定,以改良的有限稀釋法分離、培養(yǎng)Fb克隆,通過(guò)原位雜交方法檢測(cè)Fb克隆I型前膠原α1鏈(COL

2、1A1)mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果：建立5個(gè)SSc患者皮膚Fb細(xì)胞系和4個(gè)正常人皮膚Fb細(xì)胞系,經(jīng)免疫組化法鑒定培養(yǎng)的細(xì)胞為Fb。經(jīng)分離、培養(yǎng)共獲得68個(gè)Fb克隆(克隆第四代),包括SSc患者36個(gè)Fb克隆和正常人32個(gè)Fb克隆。原位雜交法顯示SSc組Fb克隆COL1A1mRNA的平均OD值(6.636±2.480)高于正常對(duì)照組(3.693±2.007),t=3.690,P=0.001。通過(guò)聚類分析將所有克隆的平均OD值分為

3、高、中、低三組。SSc組和正常對(duì)照組Fb克隆高、中、低三組的總體構(gòu)成比不同(P=0.005)。SSc組COL1A1mRN,A高表達(dá)組克隆的比例高于正常對(duì)照組。在此基礎(chǔ)上,本課題組另一成員對(duì)Fb克?、裥颓澳z原蛋白(免疫印跡和ELISA法)和COL1A1、COL3A1mRNA(實(shí)時(shí)定量RT-PCR,Taqman探針?lè)?的測(cè)定結(jié)果表明:(1)SSc組Fb克隆COL1A1mRNA與COL3A1mRNA水平的異質(zhì)性較正常對(duì)照組大;(2)Fb克?、?/p>

4、型前膠原蛋白表達(dá)與其mRN,A水平呈正相關(guān);(3)Fb克隆的COL1A1mRNA水平與COL3A1mRNA水平呈正相關(guān)。并將Fb克隆分為高、中、低膠原合成組。SSc組高膠原合成克隆的比例及其平均膠原合成量高于正常對(duì)照組高膠原合成克隆。
　　 結(jié)論：SSc患者皮膚Fb高膠原合成克隆的比例及其膠原合成增高的幅度大于正常人。
　　 第二部分SSc患者和正常人膠原合成異質(zhì)性Fb克隆的膠原基因轉(zhuǎn)錄特性研究
　　 目的：了解

5、SSc患者和正常人膠原合成異質(zhì)性Fb克隆的膠原基因轉(zhuǎn)錄特性。
　　 方法：構(gòu)建含人COL1A1和COL3A1基因啟動(dòng)子片段的重組質(zhì)粒,采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)測(cè)定COL1A1和COL3A1基因啟動(dòng)子在膠原合成異質(zhì)性Fb克隆中的活性。通過(guò)染色質(zhì)免疫沉淀(ChIP)分析法結(jié)合定量PCR法檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子Sp1與不同F(xiàn)b克隆COL1A1基因近端啟動(dòng)區(qū)的結(jié)合活性。
　　 結(jié)果：經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和測(cè)序鑒定,所有重組質(zhì)

6、粒構(gòu)建正確。經(jīng)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染、報(bào)告基因測(cè)活發(fā)現(xiàn)COL1A1-174bp～+42bp、COL3A1-96bp～+16bp在不同F(xiàn)b克隆中具有相對(duì)最高或較高的活性,并且其活性分別與Fb克?、裥?Ⅲ型前膠原表達(dá)呈正相關(guān)。ChIP、定量PCR結(jié)果顯示,Sp1與高膠原合成克隆COL1A1近端啟動(dòng)區(qū)-174bp～+42bp的結(jié)合活性高于低膠原合成克隆(P＜0.05),這種差異在SSc組較正常對(duì)照組更為明顯(F=24.569,P=0.000)。
　　

7、 結(jié)論：SSc患者高膠原合成Fb克隆的Ⅰ型、Ⅲ型前膠原基因在轉(zhuǎn)錄水平即被激活;轉(zhuǎn)錄因子Sp1可能參與上調(diào)SSc患者高膠原合成Fb克隆COL1A1-174bp～+42bp啟動(dòng)片段的活性。
　　 第三部分細(xì)胞因子和丹參對(duì)SSc患者膠原合成異質(zhì)性Fb克隆膠原基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)控
　　 目的：研究細(xì)胞因子、丹參及其單體對(duì)SSc患者膠原合成異質(zhì)性Fb克?、裥汀ⅱ笮颓澳z原基因轉(zhuǎn)錄的影響。
　　 方法：以瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法將含有人COL

8、1A1-174bp～+42bp、COL3A1-96bp～+16bp啟動(dòng)片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SSc患者和正常人膠原合成異質(zhì)性Fb克隆,施加細(xì)胞因子、丹參及其單體干預(yù)48h后,通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)測(cè)定COL1A1和COL3A1近端啟動(dòng)區(qū)的活性。
　　 結(jié)果：TGF-β1(5ng/mL)、CTGF(20ng/mL)上調(diào)COL1A1、COL3A1近端啟動(dòng)區(qū)在SSc患者和正常人Fb克隆中的活性,其中CTGF在SSc患者優(yōu)先上調(diào)CO

9、L3A1近端啟動(dòng)區(qū)在低膠原合成Fb克隆中的活性。丹參注射液(1mg/mL)、丹參酮ⅡA(5μg/mL)抑制COL1A1、COL3A1近端啟動(dòng)區(qū)在SSc患者和正常人Fb克隆中的活性,并且優(yōu)先下調(diào)兩者在SSc患者高膠原合成Fb克隆中的活性;原兒茶醛(5μg/mL)和丹酚酸B(5μg/mL)分別選擇性抑制COL1A1和COL3A1近端啟動(dòng)區(qū)在Fb克隆中的活性。未發(fā)現(xiàn)IFN-γ(100ng/mL)、丹參素鈉(20μg/mL)抑制COL1A1和C