利用循環(huán)microRNA診斷骨質(zhì)疏松的臨床研究.pdf

1、背景:骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis）是全球第四大危害人類健康的疾病，主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性的骨量丟失（bone loss）和骨骼脆性（skeleton fragility）增加。骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生與發(fā)展通常沒(méi)有明顯的癥狀（symptom），一般是在體格檢查或者并發(fā)癥發(fā)生時(shí)才被發(fā)現(xiàn)。脆性骨折（fragility fracture）是骨質(zhì)疏松癥的最主要、也是最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，有近一半的骨質(zhì)疏松患者曾至少發(fā)生過(guò)一次脆性骨折。長(zhǎng)骨和中心骨的骨

2、折常導(dǎo)致患者行動(dòng)不便、癱瘓甚至死亡，給家庭、社會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)與精神負(fù)擔(dān)。因此，骨質(zhì)疏松的早期診斷對(duì)于預(yù)防嚴(yán)重的骨量丟失和脆性骨折是至關(guān)重要的。目前，臨床診斷骨質(zhì)疏松癥的金標(biāo)準(zhǔn)（gold standard）是基于雙能X線掃描術(shù)（dual energy X-ray absorptiometry，DXA）的骨密度檢測(cè)。然而，較高的價(jià)格、不可移動(dòng)性以及潛在的輻射危險(xiǎn)都限制了DXA在臨床中的應(yīng)用。所以，探索一種靈敏性高、特異性強(qiáng)、方便性佳的骨質(zhì)

3、疏松診斷技術(shù)對(duì)于骨質(zhì)疏松的防治是必要的。
　　循環(huán)microRNA（circulating microRNA）是一種存在于體液中的微小RNA，在體內(nèi)能夠特異性表達(dá)，在體外能夠長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定存在。與傳統(tǒng)血清學(xué)標(biāo)志物相比，循環(huán)microRNA具有靈敏性高、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定性好等多種優(yōu)勢(shì)。研究表明，循環(huán)microRNA表達(dá)的異常與疾病的病理生理進(jìn)程具有高度的相關(guān)性，因此具有作為分子診斷標(biāo)志物的巨大潛力。目前，循環(huán)microRNA作為分子標(biāo)志物

4、，已在腫瘤及全身多系統(tǒng)疾病中表現(xiàn)出了較好的診斷效能（diagnostic performance）。雖然有研究發(fā)現(xiàn)循環(huán)microRNA在骨質(zhì)疏松和其它骨骼疾病中的表達(dá)譜異常，但是，循環(huán)microRNA在骨質(zhì)疏松癥中的診斷作用及效能的評(píng)價(jià)有待研究。
　　目的:本研究試圖通過(guò)高通量microRNA芯片研究、大樣本量訓(xùn)練研究、獨(dú)立驗(yàn)證研究以及動(dòng)物模型研究等序列研究，探索骨質(zhì)疏松發(fā)生過(guò)程中循環(huán)microRNA表達(dá)譜的變化，明確循環(huán)micr

5、oRNA在骨質(zhì)疏松診斷中的作用及診斷效能，為骨質(zhì)疏松的分子生物學(xué)診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:
　　1.樣本代表性的評(píng)價(jià)。利用構(gòu)成比分析法、箱狀圖分析法及相關(guān)性分析法等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)生物樣本庫(kù)中樣本的基本信息、骨密度、T值等臨床資料進(jìn)行分析，與全國(guó)骨質(zhì)疏松流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，明確樣本的代表性。
　　2.差異性表達(dá)的循環(huán)microRNA的初步篩選。將各組樣本等比例混樣，利用高通量microRNA芯片檢測(cè)技術(shù)篩選骨量正

6、常、骨量降低、骨質(zhì)疏松三者間差異性表達(dá)的循環(huán)microRNA。并通過(guò)表達(dá)量、變化趨勢(shì)以及保守性等標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步篩選microRNA。
　　3.循環(huán)microRNA在診斷骨質(zhì)疏松中作用及效能的評(píng)價(jià)。利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)對(duì)骨量正常、骨量降低、骨質(zhì)疏松樣本（共288例）的循環(huán)microRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)箱狀圖分析法、受試者工作特征曲線分析法明確循環(huán)microRNA在三組樣本中的變化趨勢(shì)，以及對(duì)骨質(zhì)疏松的診斷效能。
　　

7、4.聯(lián)合診斷模型的建立及評(píng)價(jià)。通過(guò)Logistic regression模型篩選對(duì)聯(lián)合診斷模型有顯著貢獻(xiàn)的microRNA，并建立基于Logistic regression方程和簡(jiǎn)單線性方程的聯(lián)合診斷模型。通過(guò)箱狀圖分析法、受試者工作特征曲線分析法明確循環(huán)microRNA在三組樣本中的變化趨勢(shì)，以及對(duì)骨質(zhì)疏松的診斷效能。通過(guò)與傳統(tǒng)骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物的比較，明確基于循環(huán)microRNA的聯(lián)合診斷模型的優(yōu)勢(shì)。
　　5.循環(huán)microRNA及

8、聯(lián)合診斷模型在診斷骨質(zhì)疏松中作用及效能的獨(dú)立驗(yàn)證。利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)對(duì)骨量正常、骨量降低、骨質(zhì)疏松樣本（共160例）的循環(huán)microRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)箱狀圖分析法、受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve，ROC curve）分析法驗(yàn)證循環(huán)microRNA及聯(lián)合診斷模型在三組樣本中的變化趨勢(shì)，以及對(duì)骨質(zhì)疏松的診斷效能。通過(guò)與傳統(tǒng)骨轉(zhuǎn)換標(biāo)志物的比較，驗(yàn)證基于循環(huán)m

9、icroRNA的聯(lián)合診斷模型的優(yōu)勢(shì)。
　　6.循環(huán)microRNA在骨質(zhì)疏松預(yù)警及療效監(jiān)測(cè)中的作用及評(píng)價(jià)。通過(guò)建立衰老模型、卵巢切除模型及細(xì)胞治療模型模擬人類骨質(zhì)疏松和抗骨質(zhì)疏松治療。利用microCT掃描技術(shù)對(duì)不同年齡小鼠、卵巢切除后不同時(shí)間的大鼠、細(xì)胞治療后大鼠的骨密度進(jìn)行檢測(cè)。利用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)對(duì)動(dòng)物模型的循環(huán)microRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)箱狀圖分析法、受試者工作特征曲線分析法明確循環(huán)microRNA的變化趨

10、勢(shì)及診斷效能，明確循環(huán)microRNA在骨質(zhì)疏松預(yù)警、療效檢測(cè)方面的作用。
　　結(jié)果:
　　1.生物樣本庫(kù)中共納入了678例樣本，骨質(zhì)疏松樣本在總樣本中、男性樣本中、女性樣本中所占比例與全國(guó)骨質(zhì)疏松流行病學(xué)調(diào)查的結(jié)果相近；骨密度與年齡、身高、體重、BMI等具有一定的相關(guān)性，與全國(guó)骨質(zhì)疏松流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果一致。
　　2.通過(guò)高通量microRNA芯片及納入標(biāo)準(zhǔn)，篩選出22個(gè)在骨量正常、骨量降低、骨質(zhì)疏松中漸變性、差異性表

11、達(dá)的循環(huán)microRNA，其中13個(gè)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，9個(gè)呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。
　　3.通過(guò)大樣本量訓(xùn)練研究，進(jìn)一步篩選出10個(gè)在骨量正常、骨量降低、骨質(zhì)疏松中漸變性、差異性表達(dá)的microRNA。這10個(gè)microRNA能夠單獨(dú)診斷骨質(zhì)疏松，但曲線下面積（AUC）、靈敏性、特異性及準(zhǔn)確性均不理想。
　　4.成功建立了聯(lián)合診斷模型。與單個(gè)循環(huán)microRNA相比，聯(lián)合診斷模型診斷骨質(zhì)疏松的曲線下面積（AUC）、靈敏性、特異性及準(zhǔn)確性均

12、大幅提升?；贚ogistic regression方程建立的Index1的診斷效能高于基于簡(jiǎn)單線性方程建立的Index2。與血清tPINP和β-CTx相比，Index1的診斷效能明顯升高；三者聯(lián)合診斷模型Index1+P+C的診斷效能并不優(yōu)于Index1。
　　5.通過(guò)獨(dú)立驗(yàn)證研究，確認(rèn)了單個(gè)循環(huán)microRNA能夠單獨(dú)診斷骨質(zhì)疏松，但曲線下面積（AUC）、靈敏性、特異性及準(zhǔn)確性均不理想。聯(lián)合診斷模型診斷骨質(zhì)疏松的曲線下面積（A

13、UC）、靈敏性、特異性及準(zhǔn)確性較單個(gè)循環(huán)microRNA確有顯著提升。Index1的診斷效能高于Index2及血清tPINP、β-CTx，并且Index1+P+C的診斷效能并不優(yōu)于Index1。
　　6.通過(guò)動(dòng)物模型，明確了2月齡、8月齡、12月齡、16月齡小鼠的骨密度逐漸降低，血清miR-199a-5p的表達(dá)量逐漸降低。明確了假手術(shù)、卵巢切除后1天、卵巢切除后2周、卵巢切除后8周的大鼠骨密度逐漸降低，血清miR-199a-5p的

14、表達(dá)量逐漸降低。明確了BMMSCs系統(tǒng)注射后，卵巢切除大鼠的骨量丟失明顯減少，成骨平衡活性增強(qiáng)、破骨活性減弱，血清miR-199a-5p的表達(dá)量回升。
　　結(jié)論:
　　1.我們建立的生物樣本庫(kù)所納入的樣本能夠反映骨質(zhì)疏松流行病學(xué)基本特征，具有較好的臨床代表性。
　　2.骨量正常、骨量降低和骨質(zhì)疏松三類人群的血清microRNA表達(dá)譜存在差異，基于循環(huán)microRNA的分子生物學(xué)診斷方法可以有效診斷骨質(zhì)疏松，并且具有替代