基于大鼠肝臟細(xì)胞色素P450酶的雷公藤內(nèi)酯代謝研究.pdf

1、雷公藤內(nèi)酯（triptolide，TP）是從衛(wèi)矛科植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. F.）中分離出來(lái)的一種具有顯著的抗炎、免疫抑制、抗腫瘤和抗生育等生理活性物質(zhì)，但由于其明顯的毒副作用，在臨床上的應(yīng)用受到了極大的限制。近年來(lái)藥物代謝研究受到越來(lái)越多的關(guān)注，大量研究結(jié)果表明，藥物的代謝過(guò)程與其活性及毒性密切相關(guān)。作為細(xì)胞內(nèi)微粒體單加氧酶系最重要核心組分的細(xì)胞色素P450酶（cytochrome P450

2、，CYP450）與藥物代謝關(guān)系最密切，它對(duì)內(nèi)源性物質(zhì)及藥物等外源性物質(zhì)的代謝起著重要作用。雷公藤制劑臨床使用時(shí)引起的中毒反應(yīng)個(gè)體差異大，不同年齡段病人毒性反應(yīng)發(fā)生率存在明顯差異，而且還具有明顯的時(shí)辰毒理學(xué)特征，提示我們TP代謝過(guò)程與其毒性反應(yīng)的相關(guān)性值得研究。目前僅有少量關(guān)于雷公藤代謝的研究報(bào)道。本論文探討了基于大鼠肝微粒體CYP450酶介導(dǎo)下的TP的代謝過(guò)程及鼠齡、性別對(duì)其代謝的影響；研究了主要代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及活性、參與TP代謝的CY

3、P450同工酶之一CYP3A誘導(dǎo)劑對(duì)TP藥物動(dòng)力學(xué)及毒性影響以及TP對(duì)CYP450酶活性的影響，為進(jìn)一步探討雷公藤毒性機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)，也可為臨床合理用藥及進(jìn)一步的新藥研發(fā)提供參考。本論文完成的主要研究工作有：
　　 （1）建立了一種簡(jiǎn)便、快速測(cè)定大鼠肝微粒體中TP的HPLC法。TP在1.98～158.20μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。采用LC/MS方法對(duì)TP在大鼠肝微粒體中4種代謝產(chǎn)物進(jìn)行了初步鑒

4、定，結(jié)果顯示代謝產(chǎn)物可能均為T(mén)P的單羥基化產(chǎn)物。TP在人肝微粒體中代謝產(chǎn)生的3種代謝產(chǎn)物與在大鼠肝微粒體中代謝產(chǎn)物M2、M3、M4相同。采用CYP450選擇性抑制劑對(duì)參與TP代謝的亞型酶進(jìn)行研究。結(jié)果顯示，CYP1A2、CYP3A4和CYP2C9 介導(dǎo)了TP在大鼠肝微粒體中的代謝。CYP3A4與M2、 M3和M4的形成有關(guān)，特別是對(duì)M3的生成起著重要的作用。CYP2C9同樣與M2、M3和M4的生成有關(guān)。CYP1A2主要影響M4的生成，對(duì)

5、M1、M2的生成也有一定的作用。在CYP1A1/1A2誘導(dǎo)劑三甲基膽蒽（3-MC）或CYP3A誘導(dǎo)劑地塞米松（DXM）誘導(dǎo)下，TP代謝速率顯著提高，Vmax分別是正常大鼠肝微粒體的3.45和 9.58倍，Km分別是3.14和3.57倍。在DXM誘導(dǎo)的大鼠肝微粒體中代謝產(chǎn)物M3顯著提高，M4僅有少量生成，而M1和M2均未被檢測(cè)到，同時(shí)產(chǎn)生了一個(gè)新的二羥基化產(chǎn)物。
　　 （2）對(duì)TP在不同鼠齡、性別大鼠肝微粒體中代謝動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了研究

6、。不同鼠齡的雌、雄Wistar大鼠肝微粒體總的CYP450酶水平無(wú)顯著性差異，但TP的體外代謝動(dòng)力學(xué)卻存在鼠齡及性別差異。雄性大鼠中，幼年（4周）與大齡鼠（>12月）的Km、Vmax及內(nèi)在清除率（Clint）值均相近，而成年鼠（2～3月）的Km值略低，Vmax及Clint值則明顯高于幼年與大齡鼠，表明TP在成年鼠肝微粒體中的代謝消除最快；雌性大鼠中，鼠齡對(duì)Km和Clint值影響較大，TP在幼鼠肝微粒體中的Clint值約為成年及大齡鼠的3

7、倍。幼年鼠的Km、Vmax及Clint值未顯示出性別差異，但成年及大齡鼠的性別差異則很明顯。TP在成年及大齡雌性鼠肝微粒體中的代謝產(chǎn)物均未檢測(cè)到M4，在所有雌性鼠中M2的生成量也極少，顯示代謝產(chǎn)物的生成性別差異明顯。
　　 （3）在TP體外代謝研究的基礎(chǔ)上，研究了參與TP代謝的重要CYP450亞型酶CYP3A的誘導(dǎo)劑DXM對(duì)TP體內(nèi)代謝及毒性的影響。TP在DXM 50、100mg/kg誘導(dǎo)4d后的大鼠體內(nèi)代謝顯著加快，這與體外實(shí)

8、驗(yàn)結(jié)果顯示DXM能顯著增加TP的代謝速率相吻合。與對(duì)照組相比，TP組（0.2 mg/kg，灌胃3d）大鼠血清ALT、AST、MDA水平及肝臟組織TSH、PSH均有顯著性差異，肝臟呈現(xiàn)輕微病理性改變，顯示TP引起了肝損傷；DXM組（50mg/kg，腹腔注射4d）大鼠血清ALP、BUN水平及肝臟組織TSH、PSH均有顯著性差異，顯示DXM可能引起了腎損傷及肝臟巰基的損耗；DXM（50mg/kg，腹腔注射4d）與TP（0.1、0.2、0.4

9、mg/kg， 灌胃3d）聯(lián)合使用中、高劑量組血清ALT、AST、BUN、Crea、MDA水平及肝臟組織巰基與對(duì)照組比較均無(wú)顯著性差異，ALP水平與對(duì)照組比較有顯著性差異，但與DXM組比較則有顯著性提高，表明TP與DXM合用可以降低TP引起的肝損傷，也在一定程度上可以減少地塞米松對(duì)腎的損害。結(jié)果提示TP的代謝產(chǎn)物可能具有生理活性，而且毒性可能低于TP。
　　 （4）采用HPLC半制備色譜法分別制備了TP的2個(gè)主要代謝產(chǎn)物（M3、M

10、4）。利用液-質(zhì)聯(lián)用（LC/MS/MS）及核磁共振（1H-NMR、H-H COSY、C-H HMBC）技術(shù)對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了結(jié)構(gòu)鑒定。M3為雷公藤原植物中含有的成分雷公藤內(nèi)酯二醇（Tripdiolide）；M4為19-羥基雷公藤內(nèi)酯（19-Hydroxytriptolide）。采用MTT法研究了TP及2個(gè)主要代謝產(chǎn)物M3、M4對(duì)MCF-7、HepG2細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果顯示，TP、M3在2～260ng/mL濃度范圍內(nèi)，作用48h后對(duì)兩種細(xì)

11、胞的增殖均具有明顯的抑制作用，抑制強(qiáng)度呈現(xiàn)濃度依賴性。TP、M3作用MCF-7細(xì)胞的IC50值分別為33.4 ng/mL、112.9 ng/mL，作用HepG2細(xì)胞的IC50值分別為90.4 ng/mL、108.7 ng/mL。M4在0.1～26 μg/mL濃度范圍內(nèi)，作用48h后對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，IC50為3.2 μg/mL，而對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的抑制作用不明顯。用Hochest33258染色在熒光顯微鏡下觀察

12、了TP（130ng/mL）、M3（130ng/mL）、M4（13 μg/mL）可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、碎裂、邊聚等細(xì)胞凋亡表現(xiàn)。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，TP主要代謝產(chǎn)物毒性可能低于TP。
　　 （5）研究了TP對(duì)肝微粒體酶活性的影響。結(jié)果表明，TP中、高劑量組（0.04、0.06 mg/kg/d 連續(xù)給予7d）可增加Cyt b5的含量，抑制CYP3A活性，對(duì)CYP450總量、CYP2E1的活性則無(wú)影響；高劑量組誘導(dǎo)了CYP2B1/