肝外組織細(xì)胞色素P450酶在雷公藤內(nèi)酯醇所致毒性的作用及四種化合物對(duì)肝臟CYPs表達(dá)作用的研究.pdf

1、目的:研究中藥活性物質(zhì)雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide，TP)對(duì)肝外組織器官的毒性作用，探討肝外組織P450酶在雷公滕內(nèi)酯醇代謝和產(chǎn)生毒性過程中所扮演的角色，為如何評(píng)價(jià)雷公藤內(nèi)酯醇的給藥風(fēng)險(xiǎn)，如何降低該藥的臨床毒性提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)，研究歐前胡素、異歐前胡素、延胡索乙素、四氫小檗堿四種化合物對(duì)小鼠細(xì)胞色素P450主要亞型表達(dá)的影響，為雷公藤內(nèi)酯醇配伍和聯(lián)合用藥達(dá)到減毒增效目的提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:采用肝臟外組

2、織特異性NADPH-細(xì)胞色素P450還原酶特異性敲除小鼠（Xh-CL小鼠）解決肝外組織P450酶在雷公藤內(nèi)酯醇毒性作用問題。Xh-CL小鼠肝臟組織中的P450酶代謝活性正常，肝外組織中P450酶的代謝活性極大降低。首先R-CL純合子小鼠從丁欣欣教授（美國紐約州衛(wèi)生部伍茲沃茨研究中心）處引進(jìn)，將R-CL純合子小鼠與野生型(C57BL/6)進(jìn)行雜交，然后進(jìn)行種群間的雜交得到的R-CL純合子的小鼠，R-CL雜合子小鼠與另一種轉(zhuǎn)基因小鼠Alb-

3、Cre純合子小鼠進(jìn)行雜交，篩選出含有R-CL和Cre基因的小鼠，再用R-CL純合子小鼠與含有R-CL和Cre基因的小鼠雜交，通過PCR技術(shù)篩選出含有R-CL純合和Cre基因的小鼠。利用WesternBlot技術(shù)對(duì)符合基因型的小鼠進(jìn)行蛋白表型鑒定，基因型和蛋白表型符合要求的就是Xh-CL小鼠。將得到的Xh-CL小鼠和野生型(C57BL/6)分別隨機(jī)分為空白對(duì)照組，給藥低劑量組（0.1 mg/kg TP）和給藥高劑量組（0.2 mg/kg

4、TP）。通過腹腔注射的方式給予中藥雷公藤內(nèi)酯醇(TP)，每隔一天給藥一次，持續(xù)給藥4周，隨時(shí)觀察小鼠生存情況。給藥結(jié)束后，采用心臟取血，用ELISA試劑盒測(cè)定各小鼠血清中ALT、AST、BUN以及Cr的含量變化以確定肝臟和腎臟的損傷情況;H&E染色法觀察分析肝臟、腎臟、肺、睪丸、脾臟等病理組織切片;對(duì)小腸、胃等器官觀察是否存在潰瘍;對(duì)小鼠各臟器稱重計(jì)算其臟器指數(shù)。利用UPLC法測(cè)定血清中雷公藤內(nèi)酯醇濃度，詳見本實(shí)驗(yàn)室創(chuàng)建方法。探討比較X

5、h-CL小鼠和野生型兩種小鼠對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇的體內(nèi)代謝情況。此外，為尋找對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇減毒增效的新方法，我們從中藥聯(lián)用方面入手，選取香豆素類化合物（歐前胡素和異歐前胡素）和生物堿類化合物（延胡索乙素和四氫小檗堿）幾種藥物進(jìn)行研究。選用野生型(C57BL/6)小鼠，將小鼠隨機(jī)分成空白組、低劑量組（20 mg/kg）、高劑量組（40 mg/kg），灌胃給藥15天。利用熒光定量PCR技術(shù)從分子水平檢測(cè)特定mRNA的表達(dá);Western Blot

6、法測(cè)定藥物對(duì)細(xì)胞色素P450酶中POR、CYP1A1、CYP1 A2、CYP2A、CYP2B1/2、CYP3A、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E這9種亞型蛋白含量變化;心臟取血，用ELISA試劑盒檢測(cè)血清中ALT、AST、TBil含量;H&E染色法觀察分析肝臟病理切片，分析這些藥物是否能與雷公藤內(nèi)酯醇聯(lián)用以達(dá)到減毒增效的作用。
　　結(jié)果:在Xh-CL轉(zhuǎn)基因小鼠的培育和種群擴(kuò)大過程中，第一步的小鼠雜交經(jīng)過鑒定全部為雜合子，之

7、后雜合子再雜交后鑒定出有純合子小鼠、雜合子和野生型三種小鼠，我們選取純合子備用，第二步將雜合子與Alb-Cre小鼠雜交鑒定出含有POR和Cre基因的小鼠，第三步用純合子與第二步得到小鼠雜交鑒定出符合要求的基因型。對(duì)符合基因型小鼠進(jìn)行蛋白表型鑒定時(shí)，結(jié)果也與理論一致，因此我們判定該小鼠就是目的小鼠，按此方法進(jìn)行種群擴(kuò)大。小鼠給藥實(shí)驗(yàn)中血清指標(biāo)ALT、AST均上升，且Xh-CL顯著增加，BUN、Cr均都顯著增加;臟器指數(shù)中肝臟、脾臟、睪丸均

8、有顯著變化，兩種鼠變化差異不明顯;病理切片結(jié)果顯示小鼠肝臟幾乎無損傷;肺泡中見有紅細(xì)胞，表明肺靜脈毛細(xì)管擴(kuò)張嚴(yán)重，有出血現(xiàn)象;腎近曲小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)水腫，少數(shù)近曲小管內(nèi)可見蛋白管型;睪丸中成熟精子減少，各級(jí)精母細(xì)胞減少，生精小管萎縮;脾臟中可見脾小體萎縮，脾竇擴(kuò)張出血;切片指標(biāo)顯示Xh-CL小鼠和WT小鼠無顯著性差異。藥代動(dòng)力學(xué)曲線表明兩種小鼠對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇的代謝無顯著性差異。香豆素類兩種物質(zhì)對(duì)肝臟有一定的損傷，但對(duì)代謝雷公藤內(nèi)酯醇毒性

9、的細(xì)胞色素P450酶亞型CYP3A沒有誘導(dǎo)作用。生物堿中延胡索乙素對(duì)肝臟基本沒有損傷，對(duì)CYP3A表達(dá)沒有誘導(dǎo)作用;生物堿中四氫小檗堿對(duì)肝臟損傷嚴(yán)重，同時(shí)可以誘導(dǎo)CYP3A表達(dá)顯著升高。
　　結(jié)論:長(zhǎng)期應(yīng)用雷公藤內(nèi)酯醇后，不論本身組織器官中P450酶的作用強(qiáng)弱都會(huì)導(dǎo)致對(duì)小鼠腎、脾臟和睪丸器官有較強(qiáng)的毒性作用。同時(shí)我們認(rèn)為肝外組織P450酶代謝不是雷公藤內(nèi)酯醇毒性產(chǎn)生的關(guān)鍵因素。這份研究結(jié)果建議針對(duì)降低雷公藤內(nèi)酯醇所產(chǎn)生的毒性主要關(guān)