胰島素增敏劑bpv加重病理性心肌損害的機制研究.pdf

1、背景：心肌的體積增大按照其誘因可分為三種：心肌的正常生長、生理性心肌肥大和病理性心肌肥大。與臨床上有關的是生理性心肌肥大和病理性心肌肥大。生理性心肌肥大多是由慢性靜力訓練或者妊娠引起的，而病理性心肌肥大則是由多種致病因素如高血壓，心腔疾病，心肌梗死及基因突變等造成的，病理性心肌肥大的初期對機體是有益的，但在晚期發(fā)生心肌代償作用，導致心衰。通過提高機體的心肌生理性心肌肥大來拮抗病理性心肌肥大的研究發(fā)現為預防和治療心衰提供了一條新思路。厘清

2、生理性心肌肥大發(fā)生的機制，使得我們能夠發(fā)現治療病理性心肌肥大和心衰的新的藥物靶點。釩化合物bpv(phen)，一類高活性胰島素增敏劑，是糖尿病潛在的治療試劑，這類化合物能抑制PTEN(Phosohatase and tension homologue deleted on chromosome10)，增強胰島素信號通路。而在心肌細胞中，PTEN同樣調控著生存有關的信號通路。本論文所要探索的是利用PTEN的抑制劑能否誘導生理性心肌肥大，從

3、而抑制病理性心肌肥大。
　　 目的：驗證釩化合物bpv(phen)對病理性心肌肥大的作用，以及其可能的機制。
　　 方法：主體實驗采用分離新生大鼠心肌細胞，異丙腎上腺素ISO(10μM)誘導心肌細胞的病理性心肌肥大，應用免疫熒光檢測心肌細胞面積的變化和病理性心肌肥大的蛋白指標ANF的表達量變化，同時Real-time PCR進一步檢測ANF的表達量以驗證病理性心肌肥大模型的建立。在病理性心肌肥大的細胞模型建立的基礎上，用

4、免疫熒光和Real-time PCR驗證釩化合物bpv(phen)對ANF表達量的影響，以及生理性心肌肥大指標PGC1-α表達量的變化；PI染色檢測bpv(phen)對心肌細胞的致死作用；western blot檢測bpv(phen)對生理性心肌肥大信號通路中p-Akt表達量的影響；以及免疫熒光檢測bpv(phen)對病理性心肌肥大信號通路中NFAT入核量的影響。SiRNA敲除技術驗證PLC在bpv(phen)加重病理性心肌損傷的過程中

5、所發(fā)揮的作用；RT-PCR檢測SiRNA的敲除效率，Real-time PCR和免疫熒光技術檢測敲除PLC之后bpv(phen)對ANF表達量的影響。同時本論文采用ISO(40μg/天)皮下注射和腹主動脈狹窄(TAC)誘導病理性心肌肥大的動物模型進行整體實驗的驗證。通過記錄動物模型的生存曲線和心重體重比，應用Real-time PCR檢測ANF的表達量，以及HE染色和天狼星紅染色檢測心肌的纖維化和壞死來驗證病理性心肌肥大動物模型的造模成

6、功；同時還采用相同的實驗方法檢測了bpv(phen)對這兩種病理性心肌肥大動物模型的作用。最后的實驗數據用IQ5，Image J，Excel，SPSS等軟件進行分析。
　　 結果：10μM的ISO處理導致心肌細胞面積的增大和病理性心肌肥大的蛋白標志ANF表達上調9.6倍，驗證了病理性心肌肥大的細胞模型的成功。同ISO相比，有效濃度(0.1μM-4μM)的胰島素增敏劑bpv(phen)導致ANF的表達上調，而生理性心肌肥大的蛋白標

7、志PGC1-α的表達并無上調。通過胰島素(1μg/mL)的處理增強bpv的效果，亦或是加入病理性心肌肥大信號通路PKC/PKD的抑制劑6976，ANF的表達量都比單獨ISO處理要高，而PGC1-α的表達無變化。探求bpv(phen)作用的分子機制，發(fā)現通過western blot實驗驗證了bpv處理能提高p-Akt的表達水平，同時通過SiRNA敲除PLC，能部分抑制bpv上調ANF的表達。同時，bpv還能促進NFAT的入核，導致病理性心

8、肌肥大的基因表達上調。我們還利用ISO和主動脈狹窄(TAC)誘導病理性心肌肥大實驗驗證了bpv不但能上調病理性心肌肥大的蛋白marker ANF，NFAT等的表達，還能造成心肌的纖維化和壞死。
　　 結論：與我們的假設相反，胰島素增敏劑并沒有通過增加生理性肥大來減輕病理性肥大，反而加重了病理性肥大。相關的機制是：bpv抑制了PTEN的作用，導致細胞膜PIP3濃度升高，后者通過激活PLC，產生大量IP3和DAG，進而導致CaN-N