胰島素對(duì)大鼠心肌梗死后膠原重塑的影響及機(jī)制研究.pdf

1、心肌梗死（myocardial infarction, MI）后左心室病理性重塑是導(dǎo)致左心室進(jìn)行性的擴(kuò)張、心臟收縮舒張功能下降，最終引起心力衰竭發(fā)生發(fā)展的重要原因。在心臟病理性重塑中，心肌間質(zhì)中的膠原纖維發(fā)生變化，表現(xiàn)為膠原總量增加、Ⅰ型膠原含量增加、Ⅲ型膠原含量降低、Ⅰ/Ⅲ型膠原比例升高，稱為心肌膠原重塑。近年來研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblast, CF)在心肌梗死后心室病理性重塑發(fā)生發(fā)展中起重要作用。成纖維細(xì)

2、胞可分泌合成膠原，維持心臟正常膠原網(wǎng)絡(luò)構(gòu)象；在一些體液因子和機(jī)械刺激下，成纖維細(xì)胞分化轉(zhuǎn)變?yōu)榧±w維母細(xì)胞（myofibrast），引起膠原蛋白、纖維連接蛋白和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白（matrix metalloproteinases， MMPS）合成增加，導(dǎo)致纖維化。由此可見，成纖維細(xì)胞不僅是參與心肌梗死后創(chuàng)傷修復(fù)與膠原沉積的主要細(xì)胞，而且在心肌間質(zhì)纖維化和心室病理性重塑中處于中心地位，正成為治療心力衰竭的新靶點(diǎn)。
　　前期研究發(fā)現(xiàn)胰島素

3、可激活“生存信號(hào)”磷脂酰肌醇三羥基激酶-蛋白激酶 B-內(nèi)皮型一氧化氮合酶（PI3K-Akt-eNOS）機(jī)制，顯著抑制缺血后心肌細(xì)胞凋亡，改善大鼠心肌梗死后心臟結(jié)構(gòu)和功能。然而給予胰島素治療，是否會(huì)對(duì)心肌梗死后膠原重塑產(chǎn)生影響，尚不清楚。
　　因此，本實(shí)驗(yàn)采用大鼠心肌梗死模型，觀察胰島素治療對(duì)MI后心肌膠原重塑的影響；并探討成纖維細(xì)胞在其中的作用。
　　研究目的:
　　1.觀察胰島素治療對(duì)大鼠心肌梗死后膠原重塑的影響。<

4、br>　　2.探討胰島素影響成纖維細(xì)胞在上述膠原重塑中的作用及機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　1.整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)：成年雄性SD大鼠，冠脈左前降支永久結(jié)扎做心肌梗死模型，動(dòng)物隨機(jī)分為3組：（1）假手術(shù)組(Sham）：開胸，在冠脈左前降支處穿線，但不結(jié)扎動(dòng)脈；（2）心肌梗死組（MI+Saline）：缺血20min后，通過尾靜脈以4 ml/kg/h的速度泵注0.9％的生理鹽水2h；（3）胰島素治療組（MI+Insulin）：缺血20mi

5、n后，通過尾靜脈以4ml/kg/h的速率泵入50U/L胰島素2h，并在術(shù)后1wk內(nèi)皮下注射0.5 U/ml胰島素1ml/kg/d體重。
　　2.分別在手術(shù)后1wk和4wk時(shí)，利用超聲心動(dòng)圖(UCG)檢測(cè)左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)和左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)，計(jì)算左室短軸縮短分?jǐn)?shù)(LVFS)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，評(píng)價(jià)心臟功能。
　　3.手術(shù)后1wk和4wk時(shí)取心臟標(biāo)本，用化學(xué)法檢測(cè)心肌組織膠原總量，Weste

6、rn blot檢測(cè)平滑肌肌動(dòng)蛋白（a-SMA）的表達(dá)，以反映成纖維細(xì)胞向肌纖維母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化情況。Western blot和免疫組織化學(xué)法檢測(cè)心肌組織中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)及其比例，以此反映心肌膠原重塑。
　　4.離體實(shí)驗(yàn)：原代分離培養(yǎng)乳鼠心肌成纖維細(xì)胞，盤狀結(jié)構(gòu)域受體2（DDR2）免疫熒光染色鑒定分離的細(xì)胞。加入10 ng/ml轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)24h，體外模擬心肌膠原重塑環(huán)境，實(shí)驗(yàn)分為3組：①空白對(duì)照組(CF)

7、；②膠原重塑組(CF+TGF-β)；③胰島素處理組(CF+TGF-β+Insulin)。收集細(xì)胞采用Western blot檢測(cè)a-SMA、TGF-β信號(hào)通路關(guān)鍵分子Smad2和MAPK通路關(guān)鍵信號(hào)分子的變化。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.胰島素治療改善心肌梗死后心臟功能：手術(shù)后1wk和4wk，心肌梗死組的LVEF明顯降低（與假手術(shù)組相比，P<0.05）；胰島素治療組LVEF顯著升高（與心肌梗死組相比，P<0.05）。
　

8、　2.胰島素治療改善心肌梗死后的膠原合成：羥脯氨酸測(cè)膠原總量的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在梗死周邊區(qū)，心肌梗死組的心肌膠原含量增高（與假手術(shù)組相比，P<0.01），胰島素治療組則明顯下降（與心肌梗死組相比，P<0.05）。a-SMA蛋白的表達(dá)，心肌梗死組明顯升高，（與假手術(shù)組相比，P<0.01），胰島素治療組明顯降低a-SMA蛋白的表達(dá)（與心肌梗死組相比，P<0.01）。
　　3.胰島素治療降低心肌梗死后Ⅰ/Ⅲ型膠原比例：Western blot

9、和免疫組織化學(xué)法均發(fā)現(xiàn)，心肌梗死組術(shù)后1wk和4wk時(shí)梗死周邊區(qū)Ⅰ/Ⅲ型膠原比例顯著升高（與假手術(shù)組相比，P<0.05）；胰島素治療后，可降低1wk時(shí)Ⅰ/Ⅲ型膠原比例（與心肌梗死組相比，P<0.05），不能明顯改變4wkⅠ/Ⅲ型膠原比例（與心肌梗死組相比，P>0.05）。
　　4.離體實(shí)驗(yàn)顯示胰島素降低TGF-β刺激后a-SMA蛋白的表達(dá)和Smad2的磷酸化：Western blot證實(shí)膠原重塑組a-SMA蛋白的表達(dá)和Smad2的

10、磷酸化水平均升高（與空白對(duì)照組相比，P<0.05），胰島素處理組與膠原重塑組相比，a-SMA蛋白的表達(dá)和Smad2的磷酸化水平顯著降低（P<0.05）。
　　5.胰島素可降低TGF-β刺激后JNK的磷酸化：Western blot結(jié)果表明，膠原重塑組與空白對(duì)照組相比，JNK的磷酸化水平明顯升高（P<0.05），胰島素處理后15min到120min，TGF-β刺激引起的JNK的磷酸化水平降低（與膠原重塑組相比，P<0.05）。而ER