Chemerin對心肌胰島素抵抗的誘導作用及其機制研究.pdf

1、糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一組以高血糖引起胰島素抵抗為主要標志的代謝紊亂綜合征，可導致多種并發(fā)癥，比如糖尿病腎病，糖尿病視網(wǎng)膜病變，糖尿病心肌病。脂肪組織是一種內分泌器官，可分泌多種脂肪因子，如脂聯(lián)素、瘦素、內脂素、IL-6等。大量的實驗證據(jù)表明，脂肪因子影響多種組織的葡萄糖代謝。Chemerin又被稱為維甲酸受體反應元件2（retinoicacid receptor responder protein2，RA

2、RRES2）或者他扎羅汀誘導基因2(Tazarotene-induced gene2，TIG2)，是最近發(fā)現(xiàn)的一種脂肪因子，與炎癥，脂肪代謝和胰島素抵抗等具有相關性。已有研究證明，Chemerin及其受體—趨化因子樣受體1（chemokine-like receptor1，CMKLR1或ChemR23）在許多組織中表達，特別是在白色脂肪組織、肝臟和腎臟中表達較。目前的研究顯示，人類血漿chemerin的高表達是炎癥和代謝綜合癥的標志物之

3、一。因此，Chemerin可能參與了胰島素抵抗和糖尿病的發(fā)生發(fā)展。
　　然而，在不同的細胞中，chemerin在胰島素抵抗中發(fā)揮的作用尚存爭議。最近的一項研究發(fā)現(xiàn)人類骨骼肌細胞雖然不表達chemerin，但是表達chemerin的受體CMKL1。Chemerin通過破壞胰島素信號，可誘導骨骼肌細胞產(chǎn)生胰島素抵抗。但是，在體外3T3-L1細胞的研究中尚存爭議。Takahashi等發(fā)現(xiàn)chemerin能夠促進胰島素刺激下的3T3-L1

4、細胞對葡萄糖的攝取，而Kralisch S等發(fā)現(xiàn)chemerin抑制胰島素刺激下3T3-L1細胞對葡萄糖的攝取率的增加。這種相反結果的產(chǎn)生可能與chemerin同時參與胰島素作用的靶組織對胰島素敏感性的負性調節(jié)有關。
　　國外已有研究證實大鼠心臟組織表達chemerin及其受體CMKLR1，但是尚無體外實驗報道心肌細胞表達chemerin以及chemerin在心肌細胞胰島素抵抗中的作用。糖尿病心肌病是糖尿病的一個重要并發(fā)癥，因此我

5、們從細胞水平研究在心肌細胞中chemerin/ChemR23系統(tǒng)與胰島素抵抗的關系。本實驗體外培養(yǎng)SD乳鼠原代心肌細胞和心臟成纖維細胞，檢測心肌細胞和心臟成纖維細胞是否表達chemerin，并探討心肌細胞chemerin的表達與胰島素抵抗的關系及其分子學機制。本研究主要包括以下四部分:
　　第一部分、Chemerin在乳鼠心肌細胞和心臟成纖維細胞中的表達
　　目的:購買出生2～3天的SD乳鼠，成功提取并培養(yǎng)SD乳鼠原代心肌細

6、胞和心臟成纖維細胞，觀察其是否表達chemerin，為下一步研究奠定基礎。
　　方法:購買出生2～3天的SD乳鼠，提取并培養(yǎng)原代心肌細胞和心臟成纖維細胞，應用Real-Time-PCR、Western-Blot技術觀察心肌細胞和心臟成纖維細胞是否表達chemerin。
　　結果:Real-Time-PCR結果示乳鼠心肌細胞和心臟成纖維細胞均有chemerin mRNA的表達。Western-Blot結果示乳鼠心肌細胞和心臟成

7、纖維細胞均有chemerin蛋白的表達結論: SD乳鼠心肌細胞和心臟成纖維細胞正常情況下均能夠表達chemerin。
　　第二部分、高糖和炎癥環(huán)境下乳鼠心肌細胞chemerin表達的變化
　　目的:觀察高糖和炎癥因子TNF-α對乳鼠心肌細胞chemerin mRNA表達的影響方法:購買出生2～3天的SD乳鼠，提取并培養(yǎng)原代心肌細胞，培養(yǎng)48小時后換為無血清的低糖DMEM培養(yǎng)基(葡萄糖濃度為5.5mmol/L)繼續(xù)培養(yǎng)24小時

8、，然后分組后繼續(xù)培養(yǎng):
　　1.觀察葡萄糖干預心肌細胞后chemerin mRNA表達的變化:(1)不同濃度的葡萄糖干預24小時:對照組(5.5mmol/L)組、10mmol/L組、20mmol/L組、30mmol/L、40mmol/L組和高滲組(5.5mmol/L葡萄糖+34.5mmol/L甘露醇)。應用Real-Time PCR技術檢測各組心肌細胞chemerin mRNA的表達。(2)30mmol/L的葡萄糖干預不同時間:0

9、小時、6小時、12小時、24小時和48小時。應用Real-Time PCR技術檢測各組心肌細胞chemerin mRNA的表達。
　　2.觀察TNF-α干預心肌細胞后chemerin mRNA表達的變化:(1)不同濃度的TNF-α干預24小時:空白對照組、5ng/ml組、10ng/ml組和20ng/ml組。應用Real-Time PCR技術檢測各組心肌細胞chemerin mRNA的表達。(2)20ng/ml的TNF-α干預不同時

10、間:0小時、6小時、12小時、24小時和48小時。應用Real-Time PCR技術檢測各組心肌細胞chemerin mRNA的表達。
　　結果:
　　1.高糖可誘導乳鼠心肌細胞chemerin mRNA的表達增加。(1)隨著葡萄糖干預濃度的增加，心肌細胞chemerin mRNA的表達隨之增加，在葡萄糖濃度30mmol/L組達到峰值，差異與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);40mmol/L組較30mmol/L組表達降

11、低，但差異無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);與對照組相比，高滲組chemerin mRNA的表達并沒有明顯的變化，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。(2)隨著葡萄糖干預時間的延長，心肌細胞chemerin mRNA的表達水平隨之升高，在24小時達到峰值，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);48小時組較24小時表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　2.TNF-α也可誘導乳鼠心肌細胞chemerin mRNA的表達增加。(1)隨

12、著TNF-α干預濃度的增加，心肌細胞chemerin mRNA的表達隨之增加，在TNF-α濃度20ng/ml組達到最高值。5ng/ml組與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，10ng/ml組、20ng/ml組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。(2)隨著TNF-α干預時間的延長，心肌細胞chemerin mRNA的表達水平隨之升高，在24小時達到峰值，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;48小時組較24小時組表達略降低，

13、差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　結論:高糖環(huán)境中和炎癥狀態(tài)下乳鼠心肌細胞chemerin mRNA的表達均上調。
　　第三部分、Chemerin誘導心肌細胞產(chǎn)生胰島素抵抗
　　目的:探討chemerin是否破壞胰島素信號，引起心肌細胞的胰島素抵抗。
　　方法:購買出生2～3天的SD乳鼠，提取并培養(yǎng)原代心肌細胞，培養(yǎng)48h后換為無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后進行分組。首先以不同濃度的chemerin（對

14、照組、10ng/ml組、100 ng/ml組）干預24小時，然后以10-7mol/l胰島素刺激30分鐘。應用Western-Blot技術檢測心肌細胞Akt、IRS-1和AMPKα的磷酸化水平，應用熒光酶標儀測定心肌細胞的葡萄糖攝取率（glucose uptake）。
　　結果:無胰島素刺激組和胰島素刺激組，隨著chemerin濃度的升高，Akt的磷酸化水平均隨之降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);無胰島素刺激組和胰島素刺激組

15、，隨著chemerin濃度的升高，IRS-1的磷酸化水平均隨之升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　無胰島素刺激組和胰島素刺激組，隨著chemerin濃度的升高，葡萄糖攝取率與AMPKα(Thr172)的磷酸化水平也隨之降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　結論:Chemerin誘導心肌細胞產(chǎn)生胰島素抵抗。
　　第四部分、Chemerin誘導心肌胰島素抵抗的分子機制
　　目的:探討chemer

16、in誘導心肌細胞產(chǎn)生胰島素抵抗的分子機制方法:購買出生2～3天的SD乳鼠，提取并培養(yǎng)原代心肌細胞，培養(yǎng)48h后換為無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h，然后進行分組。
　　1.探討chemerin可激活哪些信號通路:首先以0ng/ml或者100 ng/mlchemerin干預心肌細胞24小時，然后以10-7mol/l胰島素刺激30分鐘。應用Western-Blot技術檢測心肌細胞p38 MAPK、ERK-1/2和JNK的總蛋白水平和磷酸化

17、水平。
　　2.ERK1/2信號通路在chemerin誘導心肌細胞產(chǎn)生胰島素抵抗中的作用:應用ERK阻滯劑PD98059（50 umol/l）預干預15分鐘，之后Chemerin(100ng/ml)干預24小時，最后應用胰島素(10-7mol/l)刺激30分鐘，具體分組如下:①空白對照組;②胰島素組;③Chemerin組;④Chemerin+胰島素組;⑤PD98059+chemerin組;⑥PD98059+chemerin+胰島素

18、組。應用Western-Blot技術檢測心肌細胞Akt和AMPKα的磷酸化水平;應用熒光酶標儀測定心肌細胞的葡萄糖攝取率。
　　結果:
　　1.胰島素刺激后，chemerin可激活ERK1/2與p38MAPK信號通路:
　　無胰島素刺激組，chemerin干預后， p38 MAPK的磷酸化水平較對照組無明顯升高，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05）;但胰島素刺激組，p38MAPK磷酸化水平較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P

19、＜0.05）。無胰島素刺激組與胰島素刺激組，chemerin干預后，ERK-1/2的磷酸化水平均較對照組升高，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05）。無胰島素刺激組與胰島素刺激組，chemerin干預后，JNK的磷酸化水平均較對照組無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　2.ERK1/2阻滯劑可部分逆轉chemerin誘導的心肌細胞胰島素抵抗:
　　胰島素刺激組，chemerin和PD98059干預后，Akt的磷酸化水