炎癥因子IL-17與纖維化因子TGF-β在腹腔手術(shù)術(shù)后腹腔粘連形成中的作用及相互影響研究.pdf

1、第一部分胃腸外科手術(shù)后腹腔引流液的分析檢測(cè)
　　目的：探討胃腸外科患者手術(shù)后腹腔引流液中炎癥因子成分的濃度變化規(guī)律
　　方法：利用外科手術(shù)術(shù)后腹腔內(nèi)常規(guī)留置腹腔引流管的治療特點(diǎn)，不額外增加創(chuàng)傷的收集手術(shù)后患者的腹腔引流液。取患者在手術(shù)剛開始時(shí)，取患者剛開腹時(shí)的腹腔內(nèi)腹水；并收取患者在手術(shù)后1-7天的，每日清晨時(shí)分時(shí)間點(diǎn)，患者腹部的腹腔引流管引流出的新鮮的腹腔引流液。在4℃10000 rpm/min離心處理后，收取上清液并存在

2、-80℃冰箱。在完成足夠例數(shù)的引流液收集后，使用ELISA法檢測(cè)患者腹腔引流液中炎癥因子IFN-γ、IL-17以及TGF-β的濃度改變情況。給每例患者均繪制手術(shù)后腹腔內(nèi)IFN-γ、IL-17以及TGF-β的濃度變化曲線圖。使用方差分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法比較不同時(shí)間點(diǎn)上述檢測(cè)指標(biāo)變化的差異性。
　　結(jié)果:從2012年10月至2014年4月，共收集了武漢協(xié)和醫(yī)院胃腸外科接受了開腹手術(shù)的結(jié)腸癌根治術(shù)患者60例（已排除所有在術(shù)后出現(xiàn)了腸漏/

3、疑似感染等特殊情況的患者）?？梢娫谑中g(shù)前，患者的腹腔液體中，IL-17與IFN-γ均處于極低水平。臨床手術(shù)后患者的腹腔引流液中IL-17含量在手術(shù)后12h即已經(jīng)開始上升，術(shù)后24h即達(dá)到峰值（68.18±12.36 pg/ml）.隨后迅速下降，在手術(shù)后第二天，IL-17已經(jīng)下降到峰值的一半以下（33.16±7.24 pg/ml）；手術(shù)后第4d, IL-17已經(jīng)基本降低到基線水平。與IL-17變化趨勢(shì)類似，臨床手術(shù)患者的腹腔引流液中，IF

4、N-γ含量在手術(shù)后12h也開始迅速上升，術(shù)后第2d達(dá)到峰值（75.77±11.21pg/ml）;IFN-γ維持在較高濃度到第4d開始下降，術(shù)后第六天達(dá)到基線水平。與此不同的是，患者TGF-β在手術(shù)后12h即達(dá)到峰值82.42±10.12 pg/ml。隨后其濃度逐漸下降到第3d的37.50±7.22pg/ml.從第4天開始到患者拔出引流管的第7天，腹腔TGF-β濃度再次開始上升，其中第6d再次達(dá)到第二個(gè)峰值（95.12±16.19pg/m

5、l）.
　　結(jié)論：（1）腹部手術(shù)后，患者腹腔引流液中，炎癥因子IL-17和IFN-γ含量在手術(shù)后1-2d迅速升高并達(dá)到峰值，隨后其濃度迅速下降（在沒有術(shù)后并發(fā)感染的前提下），在手術(shù)后5-7d，重新回歸到類似于術(shù)前的基線水平。
　　（2）腹部手術(shù)后，患者腹腔引流液中，纖維化相關(guān)因子TGF-β在手術(shù)后呈現(xiàn)兩個(gè)峰值。第一個(gè)峰值出現(xiàn)在手術(shù)后12-24h,隨后TGF-β濃度會(huì)下降，但隨后會(huì)在第4d左右再次上升，在術(shù)后6-7d重新達(dá)到新

6、的峰值。
　　第二部分小鼠腹腔粘連模型的構(gòu)建與評(píng)估
　　目的：探討如何在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中穩(wěn)定模擬外科手術(shù)術(shù)后腹腔粘連形成的過程
　　方法：參考目前已有的文獻(xiàn)報(bào)道，采用開腹手術(shù)的方式構(gòu)建小鼠腹腔粘連模型。具體執(zhí)行過程為：使用滅菌的3％水合氯醛，按照小鼠體重給藥，給藥劑量為8μl/g；給藥方式采取腹腔注射。腹腔注射后大約5分鐘左右，小鼠即進(jìn)入麻醉狀態(tài)。以小鼠四肢無主動(dòng)運(yùn)動(dòng)，止血鉗試探性夾腳無反應(yīng)為麻醉滿意指標(biāo)，即可開始實(shí)驗(yàn)。

7、為確保小鼠手術(shù)創(chuàng)傷類同，取腹部正中線切口2cm,依次切開皮膚，腹肌進(jìn)入腹腔。使用無菌紗布纏繞止血鉗并使用生理鹽水打濕。采取以下不同策略模擬手術(shù)創(chuàng)傷：
　　A:腹壁摩擦20次
　　B：盲腸及其上下段每隔2cm一處一個(gè)點(diǎn)共5個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)摩擦20次
　　C:A+B
　　D：A+B但摩擦次數(shù)均減半
　　A,B,C,D四組老鼠每組10只。完成手術(shù)后第7天，處死小鼠并打開小鼠腹腔，觀察粘連形成情況，粘連形成評(píng)估采取以下

8、評(píng)分體系進(jìn)行：
　　0：無粘連
　　1：1處輕微的易剝離粘連
　　2:>1處輕微的易剝離粘連
　　3：存在1處較重的不易分離的粘連
　　4：存在>1處的較重的不易分離的粘連
　　5：存在多處較重的不易分離的粘連且粘連中有血管組織形成
　　分別評(píng)估A,B,C,D四組手術(shù)方法下，四組老鼠的粘連形成情況及死亡率情況，選取死亡率偏低而粘連形成比率最高的一組最為腹腔粘連模型構(gòu)建組。
　　結(jié)果:手術(shù)后

9、7d處死小鼠后進(jìn)行腹腔粘連評(píng)分及死亡率比較，結(jié)果如下：
　　A組：粘連得分1.8±0.3死亡率0%
　　B組:粘連得分4.0±0.2死亡率20%
　　C組：粘連得分4.3±0.5死亡率20%
　　D組：粘連得分4.2±0.4死亡率0%
　　結(jié)論：?jiǎn)为?dú)摩擦損傷腹膜并不能有效的誘導(dǎo)腹腔粘連形成，過度的摩擦腸壁將會(huì)導(dǎo)致腸道穿孔進(jìn)而致使小鼠死亡。只有同時(shí)摩擦腹壁及腸道，并控制摩擦次數(shù)，才能在保證低死亡率的背景下有效

10、的控制小鼠腹腔粘連的穩(wěn)定及成型。因此應(yīng)該選擇盲腸及其上下段每隔2cm一處一個(gè)點(diǎn)共5個(gè)點(diǎn)，每個(gè)點(diǎn)摩擦10次+腹壁摩擦10次的方法進(jìn)行小鼠腹腔粘連模型的造模。
　　第三部分小鼠腹腔粘連模型中IL-17, IFN-γ及TGF-β的表達(dá)規(guī)律及來源分析
　　目的：研究在腹腔粘連模型下，小鼠腹部炎癥因子IL-17及IFN-γ在術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的變化規(guī)律，并分析這些炎癥因子的來源及效果。同時(shí)評(píng)估纖維化形成相關(guān)關(guān)鍵因子TGF-β在腹腔中的濃度

11、變化趨勢(shì)規(guī)律。
　　方法：選取手術(shù)前,標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)后2h、4h、6h、8h、12h、24h、48h、72h,分別處死小鼠，腹腔注射無菌PBS2ml,腹腔輕柔按摩5min后，回抽腹腔灌洗液，并予以離心，洗滌，分離，細(xì)胞計(jì)數(shù)觀察炎癥細(xì)胞的浸潤程度變化（細(xì)胞計(jì)數(shù)）、再給予染色CD4、IL-17 and IFN-γ，使用FACS（流式細(xì)胞術(shù)）檢測(cè)并評(píng)估各型細(xì)胞的數(shù)量變化反復(fù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)后，進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)并得出變化趨勢(shì)圖。同時(shí)，對(duì)每一步離心后的上清液

12、，快速存儲(chǔ)于-80℃冰箱，待各個(gè)時(shí)間點(diǎn)各種樣本收齊后，使用ELISA法，測(cè)定腹腔灌洗液中上述因子的濃度改變情況。
　　結(jié)果:小鼠手術(shù)前基線狀態(tài)下，腹腔內(nèi)IL-17, IFN-γ含量接近于0（基線水平）。在手術(shù)后4h，小鼠的腹腔內(nèi)IL-17即迅速升高到峰值（123.56±19.28 pg/ml,隨后開始緩慢下降，在手術(shù)后第48h下降到46.72±7.17pg/ml,之后逐漸回歸基線水平。小鼠術(shù)后12h, IFN-γ上升到峰值70.9

13、5±19.29pg/ml隨后迅速下降到72h即處于基線水平。小鼠腹腔TGF-β在手術(shù)后4h即達(dá)到第一個(gè)峰值66.79±10.18pg/ml.隨后逐漸下降到時(shí)候24h達(dá)到低值19.18±5.28 pg/ml。隨后濃度會(huì)再次上升到時(shí)候第72h再次達(dá)到高峰103.25±20.14pg/ml.在術(shù)后炎癥反應(yīng)的峰值4-12h，小鼠腹腔中分泌IFN-γ的細(xì)胞主要為Th1細(xì)胞，分泌IL-17的細(xì)胞為γδT, Th17細(xì)胞。
　　結(jié)論:與臨床標(biāo)本

14、數(shù)據(jù)十分類似，在小鼠腹腔粘連的模型中，也存在在術(shù)后早期的IL-17, IFN-γ急性峰值。同時(shí)也可觀察到時(shí)候1-7d的時(shí)間內(nèi)，存在TGF-β的雙峰現(xiàn)象。而在小鼠模型中的手術(shù)后急性炎癥期，γδT，Th1細(xì)胞急性分泌IL-17和IFN-γ，構(gòu)成了術(shù)后早期炎癥反應(yīng)的峰值。
　　第四部分小鼠腹腔粘連模型的干預(yù)及療效分析
　　目的：探討抗炎治療及抗纖維化治療的治療時(shí)間點(diǎn)及療效評(píng)估。
　　方法：依據(jù)第三部分中測(cè)定的小鼠腹腔炎癥因子

15、及TGF-β變化規(guī)律特點(diǎn)采取不同干預(yù)治療對(duì)策如下：
　?。?）抗炎治療評(píng)估：分別使用不同濃度梯度的anti-IL-17;anti-IFN-γ;在手術(shù)后0-2天，每天注射一次（d0, d1, d2），觀察治療效果。再使用濃度梯度實(shí)驗(yàn)中的最佳梯度濃度，分別選取術(shù)后1-3天(d1, d2, d3)，術(shù)后4-6天(d4, d5, d6)兩組不同時(shí)間點(diǎn)，分別每天注射一次，觀察抗粘連起效的最佳時(shí)間點(diǎn)。
　?。?）抗纖維化評(píng)估:參照抗炎治

16、療策略，使用anti-TGF-β;觀察手術(shù)后使用不同濃度梯度及時(shí)間梯度下，anti-TGF-β對(duì)于防治腹腔粘連的效應(yīng)評(píng)價(jià)。
　　結(jié)果:100μg的抗體用量為炎癥因子IL-17，IFN-γ阻斷的最佳劑量。早期阻斷IL-17（術(shù)后d0-d2）的抗粘連效果顯著高于晚期阻斷（術(shù)后d4-d6）(1.7±0.6 vs4.1±0.9，p=0.001)。與此類似早期阻斷IFN-γ（術(shù)后d0-d2）的抗粘連效果顯著高于晚期阻斷（術(shù)后d4-d6）(1

17、.5±0.4 vs4.0±0.8, p=0.001)。但是對(duì)于TGF-β，晚期阻斷（術(shù)后d4-d6）的抗粘連效果顯著高于早期阻斷（術(shù)后d1-d3）（4.2±0.8 vs1.3±0.6, p=0.003）.
　　結(jié)論：早期的抗炎癥處理和晚期的抗TGF-β處理可預(yù)防術(shù)后粘連的形成。與此相反，晚期的抗炎處理和早期的抗TGF-β處理對(duì)于腹腔粘連的形成沒有影響。
　　第五部分炎癥因子與纖維化因子相互間影響機(jī)制分析
　　目的：探討

18、早期炎癥反應(yīng)對(duì)于后期纖維化環(huán)境平衡的影響及其作用機(jī)制。
　　方法：處死小鼠后，腹腔注射2ml胰酶-EDTA消化液；37℃下?lián)u床輕度搖15min。吸出消化液并加10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中和。離心后收集并于6孔板中培養(yǎng)。原代培養(yǎng)的腹膜間皮細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間約為1周左右，在培養(yǎng)的第二周開始進(jìn)行傳代培養(yǎng)。對(duì)傳代培養(yǎng)后指數(shù)生長(zhǎng)期的活性良好的間皮細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。模擬第三、四部分獲得的腹腔粘連炎癥及纖維化環(huán)境，采取IL-17/IFN-γ刺激24h+

19、TGF-β刺激24h的治療策略，在完成共計(jì)48h的刺激策略后，收齊培養(yǎng)細(xì)胞的上清液測(cè)定其中t-PA/PAI-1濃度；并使用WB測(cè)定細(xì)胞中TGF-β的信號(hào)通路激活情況。評(píng)價(jià)上述炎癥因子對(duì)于間皮細(xì)胞的纖維化相關(guān)信號(hào)通路，如Smad2/3, Smad7的差別影響。同時(shí)，收取第四部分中，接受不同抗體處理組小鼠的粘連組織，勻漿處理后收集其中mRNA。測(cè)定其中與Th1, Th17,γδT相關(guān)的趨化因子如SDF-1，CCL-20/22/27, KC,

20、 MIP-1/2等的表達(dá)水平改變情況。
　　結(jié)果:在細(xì)胞培養(yǎng)上清液檢測(cè)方面： PBS對(duì)照組中上清液中t-PA含量為101.32±15.12ng/ml;PAI含量為42.85±10.13ng/ml. IL-17預(yù)刺激組上清液中t-PA含量為51.12±6.02ng/ml;PAI含量為82.45±11.33ng/ml. IFN-γ刺激組上清液中t-PA含量為91.12±11.32ng/ml;PAI含量為82.45±11.33ng/ml

21、. IL-17+IFN-γ刺激組上清液中t-PA含量為31.12±802ng/ml;PAI含量為162.45±25.93ng/ml.其中IL-17+IFN-γ刺激處理后再使用TGF-β進(jìn)行刺激，間皮細(xì)胞分泌的t-AP顯著減少，PAI-1顯著增加。
　　在刺激后的細(xì)胞mRNA檢測(cè)方面：PBS對(duì)照組中間皮細(xì)胞t-PA/PAI-1 mRNA表達(dá)為1.0（作為對(duì)照組標(biāo)準(zhǔn)化）. IL-17預(yù)刺激組中間皮細(xì)胞t-PA mRNA表達(dá)為0.42±

22、0.13；PAI2.46±0.78. IFN-γ刺激組間皮細(xì)胞t-PA mRNA表達(dá)為1.02±0.43；PAI0.99±0.18. IL-17+IFN-γ刺激組間皮細(xì)胞t-PA mRNA表達(dá)為0.22±0.10；PAI6.48±2.08.其中IL-17+IFN-γ刺激處理后再使用TGF-β進(jìn)行刺激，間皮細(xì)胞表達(dá)的t-AP顯著減少，PAI-1顯著增加。
　　WB檢測(cè)也提示：與直接TGF-β刺激處理相比，IL-17+IFN-γ提前預(yù)

23、刺激處理下的間皮細(xì)胞具有更強(qiáng)的Smad2/3激活比例。
　　對(duì)手術(shù)后形成的粘連組織進(jìn)行qPCR檢測(cè)炎癥趨化因子的mRNA結(jié)果為：CCL-22及KC表達(dá)顯著提高，其他趨化因子表達(dá)差異不明顯。
　　結(jié)論：IL-17+IFN-γ刺激下的間皮細(xì)胞，對(duì)TGF-β的反應(yīng)性更強(qiáng)。其下游信號(hào)通路Smad2/3激活也更強(qiáng)。與此對(duì)應(yīng)的，其上清液中，促纖維化因子PAI-1的含量也越高。手術(shù)后，腹膜間皮組織中，炎癥趨化因子表達(dá)顯著提高，間皮細(xì)胞趨化