IL-33在肺纖維化形成中的作用及機制研究.pdf

1、目的:觀察rhIL-33（重組人白細胞介素-33）對上皮來源的A549細胞和HELF（人胚肺成纖維細胞）增殖及相關(guān)細胞標記物的影響，探討IL-33/ST2L-TRAF-6信號通路在肺纖維化發(fā)病過程中的作用及其機制。
　　 方法:分別培養(yǎng)A549細胞和HELF，用RT-PCR法檢測IL-33受體ST2LmRNA的表達;以不同濃度IL-33分別刺激上述兩種細胞，在不同時間點以MTT方法檢測不同濃度IL-33對A549細胞和HELF增

2、殖的影響（①若對增殖有影響則選擇出最佳刺激濃度;②若無影響則以Westernblot法檢測不同濃度IL-33對細胞標記物的影響，從而選擇出于預濃度）;以Real-timePCR法檢測IL-33刺激細胞后不同時間點兩種細胞標志性基因E-cadmRNA、α-SMAmRNA、VimentinmRNA和collagenⅠmRNA等的變化以及IL-33/ST2L信號通路中關(guān)鍵因子TRAF-6mRNA的表達改變;用Westernblotting法檢

3、測細胞標志性蛋白E-cad（E-鈣黏連蛋白）、α-SMA（α-平滑肌肌動蛋白）、collagenⅠ（Ⅰ型膠原）、Vimentin（波形蛋白）以及關(guān)鍵性信號分子TRAF-6（腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6）的改變。
　　 結(jié)果:(1)在A549細胞與HELF中均能成功檢測到ST2L基因的表達。
　　 (2)MTT結(jié)果顯示各組細胞生長狀態(tài)良好，隨時間延長，細胞數(shù)量不斷增多。加入不同濃度IL-33刺激細胞培養(yǎng)24h、48h、72

4、h后，A549細胞增殖與control組相比無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。而HELF在10ng/mlIL-33的刺激下細胞增值率顯著提高，在72h時作用最為明顯(P＜0.05)。因此，采用10ng/mlIL-33作為刺激濃度。
　　 (3)在不同濃度IL-33(5ng/ml、10ng/ml、50ng/ml)刺激下，A549細胞與control相比，E-cad蛋白表達量在10ng/ml處最低(P＜0.05)，α-SMA的表達呈逐漸

5、上調(diào)的趨勢(P＜0.05)。綜合上述試驗結(jié)果，A549細胞亦選用10ng/ml的IL-33刺激細胞進行下一步研究。
　　 (4)Real-timePCR顯示IL-33刺激A549細胞后，在0h～72h之間，E-cad基因表達為先下調(diào)后上調(diào)的趨勢(P＜0.05)，72h仍低于control組(P＜0.05);α-SMA、Vimentin及TRAF-6基因表達在0h～72h之間呈先上升后下降的趨勢，72h時Vimentin和TRAF

6、-6基因均高于control組(P＜0.05)，α-SMA表達在72h時亦高于control組，但統(tǒng)計學意義不明顯(P＞0.05)。IL-33刺激HELF后，在0～72hα-SMA、Vimentin、CollagenⅠ及TRAF-6等基因的表達均呈先升高后降低的趨勢(P＜0.05)，12h各基因表達量與control相比升高程度最明顯(P＜0.05)，隨后呈下調(diào)趨勢，但72h時表達水平仍高于對照組。
　　 (5)Westernb

7、lot顯示A549細胞在0～72h時，E-cad蛋白表達呈現(xiàn)先下調(diào)后上調(diào)的趨勢，72h表達量仍低于control組(P＜0.05);Vimentin、CollagenⅠ及TRAF-6蛋白等在0h～72h呈先升高后下降趨勢，72hCollagenⅠ、Vimentin蛋白表達均高于control組(P＜0.05)，TRAF-6蛋白表達在72h表達量雖高于control組，但兩組差異的統(tǒng)計學意義不明顯(P＞0.05)。
　　 用IL-

8、33刺激HELF后，α-SMA、Vimentin、CollagenⅠ蛋白的表達量及信號分子TRAF-6在0～72h內(nèi)的表達均呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，TRAF-6在72h與對照組相比仍有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，其余蛋白在72h與對照組相比統(tǒng)計學意義不明顯(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:(1)用IL-33刺激兩種細胞后，上皮細胞標志物呈先下調(diào)后上調(diào)的趨勢，間充質(zhì)細胞標志物隨著時間的延長均呈現(xiàn)先升高后降低的變化。推測在肺纖維化進程

9、中，IL-33促使上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(即EMT)，誘導成纖維細胞向肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化，并且這兩種變化在細胞受損早期修復及炎癥反應(yīng)過程中最為明顯。
　　 (2)TRAF-6表達量隨IL-33作用時間的延長先升高后降低，表明在IL-33誘導肺纖維化過程中，IL-33/ST2L-TRAF-6信號傳導系統(tǒng)被激活。隨著時間的延長，IL-33的作用逐漸減弱，推測分泌型受體sST2可能抑制了此通路的效應(yīng)，IL-33/ST2L-TRAF-6