pvdQ基因在人腸道上皮細(xì)胞中的表達(dá)作用以及對(duì)銅綠假單胞菌致病性影響的研究.pdf

1、目的：觀察銅綠假單胞菌Quorum sensing （QS）系統(tǒng)信號(hào)分子3OC12-HSL對(duì)人腸道上皮細(xì)胞系Caco-2活力及細(xì)胞凋亡的影響作用及其深入機(jī)制。構(gòu)建銅綠假單胞菌?；妇幋a基因pvdQ的真核表達(dá)載體，并檢測(cè)其在腸道上皮細(xì)胞中的表達(dá)及其表達(dá)對(duì)3OC12-HSL分子的抵御作用。
　　 方法：利用不同濃度3OC12-HSL（100-300uM）分別干擾Caco-2細(xì)胞4小時(shí)后，采用MTT法檢測(cè)Caco-2細(xì)胞干擾前后細(xì)胞活

2、性的變化及利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡變化，并使用western blot方法檢測(cè)Caco-2細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白p38/MAPK及NFκB表達(dá)變化。構(gòu)建pvdQ基因真核表達(dá)載體并使其在Caco-2細(xì)胞中表達(dá)。用3OC12-HSL分子干擾表達(dá)pvdQ基因的Caco-2細(xì)胞，利用3OC12-HSL分子感應(yīng)菌株E.coli MG4檢測(cè)干擾前后Caco-2細(xì)胞上清液中3OC12-HSL分子活性變化，利用質(zhì)譜分析儀檢測(cè)干擾前后Caco-2細(xì)胞上清液

3、中3OC12-HSL分子濃度變化，同時(shí)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)3OC12-HSL分子對(duì)表達(dá)pvdQ基因Caco-2細(xì)胞凋亡的影響作用。
　　 結(jié)果：MTT結(jié)果顯示，3OC12-HSL分子能抑制Caco-2細(xì)胞活性（P<0.05），流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，3OC12-HSL能促進(jìn)Caco-2細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡（P<0.05），且呈劑量依賴性。同時(shí)，western blot結(jié)果顯示，3OC12-HSL分子干擾細(xì)胞后，p-p38/MAPK及NFκ

4、B蛋白表達(dá)水平增加。pvdQ基因真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Caco-2細(xì)胞后，利用western blot方法檢測(cè)到PvdQ在Caco-2細(xì)胞中表達(dá)，感應(yīng)菌株E.coli MG4檢測(cè)結(jié)果表明，pvdQ基因在Caco-2細(xì)胞中表達(dá)能有效減弱Caco-2細(xì)胞上清液中3OC12-HSL活性。質(zhì)譜分析結(jié)果表明，pvdQ基因能降低Caco-2細(xì)胞上清中3OC12-HSL分子濃度，且呈時(shí)間依賴性（P<0.05）。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明，pvdQ基因在Caco-2

5、細(xì)胞中表達(dá)可抵御3OC12-HSL分子促進(jìn)Caco-2細(xì)胞凋亡的作用。
　　 結(jié)論：銅綠假單胞菌QS系統(tǒng)信號(hào)分子3OC12-HSL能抑制腸上皮細(xì)胞Caco-2細(xì)胞活性，促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機(jī)制可能與3OC12-HSL分子調(diào)控凋亡相關(guān)蛋白p38/MAPK及NFκB蛋白表達(dá)相關(guān)。成功構(gòu)建帶有銅綠假單胞菌pvdQ基因的真核表達(dá)質(zhì)粒Pires2-EGFP-pvdQ，并轉(zhuǎn)染入人腸道上皮細(xì)胞Caco-2，pvdQ基因在Caco-2細(xì)胞中表達(dá)