枇杷DNA纖維制備及FibeR-FISH技術(shù)體系的建立與應(yīng)用.pdf

1、DNA纖維熒光原位雜交（Fiber fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)iber-FISH）是一項重要的分子細(xì)胞遺傳學(xué)研究技術(shù)，在染色體高分辨率物理圖譜構(gòu)建、基因精細(xì)定位、基因序列分析以及全基因組測序等方面具有重要的應(yīng)用價值。本文利用普通二倍體枇杷‘興寧1號’為試驗材料，進(jìn)行了枇杷DNA纖維制備技術(shù)研究，并以SSR標(biāo)記序列與45SrDNA為探針，開展了枇杷Fiber-FiSH相關(guān)技術(shù)體系的研究并進(jìn)行了

2、初步應(yīng)用，主要結(jié)果如下:
　　 (1)進(jìn)行了枇杷DNA纖維制備技術(shù)的摸索，包括細(xì)胞核提取方法、試驗材料的選取與DNA纖維伸展等技術(shù)要點。對“刀切法”與“液氮研磨法”進(jìn)行細(xì)胞核提取的效果進(jìn)行了比較，并對枇杷不同發(fā)育時期的黃化子葉為試驗材料進(jìn)行細(xì)胞核提取的效果進(jìn)行了比較。采用“刀切法”相對于“液氮研磨法”進(jìn)行細(xì)胞核提取效果較好，前者簡便無毒，細(xì)胞核完整、無破損，且提取率為100％，后者操作復(fù)雜、有毒，且雜質(zhì)多，細(xì)胞核易破損不完整，得

3、率相對較低。通過“刀切法”進(jìn)行不同發(fā)育時間的黃化子葉提取細(xì)胞核的效果比較發(fā)現(xiàn)，發(fā)育4d的黃化子葉提取的細(xì)胞核含有雜質(zhì)，提取效果不好;發(fā)育10d的黃化子葉由于趨于老化且可能腐爛，因此不能提取得到細(xì)胞核;發(fā)育7d的黃化子葉提取細(xì)胞核效果最好，雜質(zhì)少、細(xì)胞核完整，且提取率為100％。對提取的細(xì)胞核濃度進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)取80mg的黃化子葉，加入30μl的細(xì)胞核貯存液所獲得的細(xì)胞核濃度為5×106-7個/ml，適宜進(jìn)行DNA纖維的制備，而加入60

4、μl的細(xì)胞核貯存液獲得的細(xì)胞核濃度則過低，不適宜于DNA纖維的制備。對DNA纖維的伸展方法進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)重力自然拉伸法與載玻片推動涂抹法制備的DNA纖維質(zhì)量相對較差，重力自然拉伸法制備的DNA纖維，可能會出現(xiàn)DNA纖維交叉、重疊且分布不均勻，而載玻片推動涂抹法則可能會導(dǎo)致DNA纖維交叉、堆積、斷裂與丟失;效果較好的是載玻片前端引流法，這種方法制備的DNA纖維伸展平直、分布均勻、無交叉重疊、無斷裂且較為完整。
　　 (2)以‘大

5、渡河枇杷’SSR標(biāo)電序列SSR1與SSR2，以及45SrDNA為探針分別進(jìn)行了中期染色體與DNAFiber上的FISH研究，同時在原有研究基礎(chǔ)上進(jìn)行了FISH體系的優(yōu)化，并結(jié)合這兩種FISH結(jié)果進(jìn)行了比較分析。
　　 FISH體系優(yōu)化主要針對雜交與變性、雜交后洗脫嚴(yán)謹(jǐn)度以及雜交信號檢測等技術(shù)要點。SSR-FISH與Fiber-FISH流程相同，在45SrDNA-FISH基礎(chǔ)上，第一，嚴(yán)格控制變性溫度與時間;第二，雜交后沈脫溫度由

6、37℃降為35℃，洗脫次數(shù)由3次降為2次;第三，Anti-Dig-FITC抗體濃度由2μg/ml提高至μg/ml，且反應(yīng)時間由1h增加至1.5h;另外，DNA纖維襯染時，DAPI濃度由2μg/ml提高至5μg/ml，染色時間由10min增加至20min。
　　 SSR1與SSR2在中期染色體與間期細(xì)胞核中均分別檢出2個位于2條染色體且信號強弱相同即均較弱、大小類似且位置相同即均位于近著絲粒區(qū)域的雜交信號，推測可能是1對同源信號;

7、45SrDNA在中期染色體與間期細(xì)胞核中檢出了4個雜交信號，其中2個較強、分布區(qū)域較大且位于染色體近端部，另2個相對較弱、分布區(qū)域較小且位于染色體近端部，推測可能為2對同源信號，并推測供目標(biāo)染色體組發(fā)生了染色體與基因的重組:同時利用原子力顯微鏡進(jìn)行雜交信號的檢測，獲得了清晰的掃描圖片，確定了信號在中期染色體上的區(qū)域、大小及表面形貌。
　　 SSR1、SSR2與45SrDNA在DNA纖維上均呈現(xiàn)典型的非連續(xù)念珠狀雜交信號，3種探針

8、在DNA纖維上雜交信號的長度分別為15～30μm、20-～35μm、30～45μm，且根據(jù)信號的非連續(xù)性與念珠狀認(rèn)為雜交信號是真實的。
　　 結(jié)合SSR1、SSR2與45SrDNA這3種探針在枇杷體細(xì)胞中期染色體與DNA纖維上的FISH研究結(jié)果，初步總結(jié)認(rèn)為:①SSR1與SSR2探針可清晰準(zhǔn)確地定位在中期染色體與DNA纖維上，F(xiàn)iber-FISH具有更高的分辨率，且認(rèn)為所用大渡河SSR標(biāo)記片段在供試‘興寧1號’的2條染色體中可能