毛豹皮樟基因組總DNA的提取及RAPD技術(shù)體系的建立.pdf

1、該試驗(yàn)以毛豹皮樟的葉片為材料,通過對(duì)不同的DNA提取方法進(jìn)行試驗(yàn),尋找最佳的毛豹皮樟DNA提取方法;優(yōu)化擴(kuò)增程序和反應(yīng)條件,建立起毛豹皮樟的RAPD技術(shù)體系;并將該技術(shù)體系應(yīng)用于80個(gè)毛豹皮樟葉片的RAPD擴(kuò)增中.結(jié)果表明:一、使用改良SDS提取法有效地解決了毛豹皮樟基因組總DNA提取中的褐變問題,同時(shí)所提取的DNA均呈白色絮狀,A<,260>/A<,280>值都在1.8以上,從檢測(cè)所得產(chǎn)率和純度可知該DNA模板完全可以用于RAPD分析

2、;另外,該方法還具有成本低、操作簡(jiǎn)單、省時(shí)等特點(diǎn).二、用CTAB法提取毛豹皮樟葉片的DNA時(shí),所得DNA量很少,而且模板中含色素、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)很多,在后期進(jìn)行RAPD擴(kuò)增時(shí),雜質(zhì)的影響導(dǎo)致擴(kuò)增不穩(wěn)定或者擴(kuò)增失敗,表明CTAB提取法對(duì)于含酚類等次生物質(zhì)較多的物種并不適用.三、擴(kuò)增程序采用:預(yù)變性溫度為94℃1min,變性溫度為94℃1min,復(fù)性溫度為34℃1min,72℃延伸2min,共45個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min,同時(shí)反應(yīng)體系

3、(20μl反應(yīng)體系)采用:dNTPs0.4μl(內(nèi)含1Nm/μl),10×PCR2μl,MgCl<,2>μl,Taq酶0.3μl(0.5u/μl),H<,2>O11.3μl,DNA模板2μl(40ng),Primer 2μl(0.8Pm/μl),能夠得到清晰穩(wěn)定的擴(kuò)增帶譜.四、將所建立的RAPD技術(shù)體系應(yīng)用于20個(gè)毛豹皮樟葉片DNA的RAPD擴(kuò)增中,篩選出16個(gè)引物,所得的譜帶清晰,多態(tài)性高達(dá)46.8﹪,反映了各試材之間在DNA序列上存