大豆穩(wěn)定AFLP體系的建立及應(yīng)用.pdf

1、隨著水稻、玉米等主要農(nóng)作物雜種優(yōu)勢利用的成功，大豆已成為少數(shù)幾個(gè)沒有大規(guī)模利用雜種優(yōu)勢的主要作物之一，其主要原因是沒有適于雜交種生產(chǎn)的不育系。自從1993年吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院孫寰等發(fā)現(xiàn)世界上第一個(gè)大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系以來，該領(lǐng)域的研究和應(yīng)用迅速發(fā)展，但是對不育的分子機(jī)理的研究報(bào)道尚屬空白。 分子標(biāo)記AFLP(Amplified fragment length polymorphism)是由荷蘭科學(xué)家Zabeau和Vos發(fā)明的。AF

2、LP結(jié)合了RFLP及RAPD的優(yōu)點(diǎn)，方便快速，只需要極少量DNA材料，不需要Southem雜交，不需要預(yù)先知道DNA的序列信息，試驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠，可以快速獲得大量的信息，而且再現(xiàn)性高，重復(fù)性好。因而非常適合于品種指紋圖譜的繪制，遺傳連鎖圖的構(gòu)建及遺傳多樣性的研究。在一些多態(tài)性很少，而且待測樣品較少的情況下(如近等基因系和BSA分析)，用AFLP分析能達(dá)到滿意的結(jié)果。高密度基因圖譜的繪制或?qū)δ硞€(gè)基因所在區(qū)域的精細(xì)作圖，AFLP是較為理想的

3、方法。AFLP技術(shù)目前不僅在小麥、水稻、玉米、大豆和棉花等主要作物上得以應(yīng)用，而且在蔬菜(馬鈴薯、番茄、鷹嘴豆等)、林木(垂枝樺、輻射松)以及擬南芥上廣泛應(yīng)用。以上多數(shù)作物的研究結(jié)果均表明，AFLP所產(chǎn)生的多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了RFLP、RAPD等，目前被認(rèn)為是DNA指紋圖譜技術(shù)中多態(tài)性最為豐富的一項(xiàng)技術(shù)。 AFLP分析步驟多，流程長，對操作人員的素質(zhì)要求較高。因此掌握技術(shù)關(guān)鍵，優(yōu)化反應(yīng)條件對穩(wěn)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果、提高工作效率尤為重要。

4、 本研究以AFLP標(biāo)記技術(shù)的主要技術(shù)關(guān)鍵及其優(yōu)化措施的幾個(gè)方面入手，建立了成熟的大豆線粒體DNA的AFLP分析體系，為挖掘大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育遺傳信息奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下： 1．通過反復(fù)試驗(yàn)，摸索出適用于大豆線粒體DNA提純的方法，所提純的線粒體DNA純度高，適于AFLP等的試驗(yàn)研究； 2．通過對內(nèi)切酶用量、酶切時(shí)間、連接時(shí)間、稀釋倍數(shù)等的研究，建立了適于大豆線粒體DNA分析的AFLP銀染技術(shù)體系。在20 μL的酶切連

5、接體系中，含純化的大豆線粒體DNA500 ng，T<,4> Ligase(5 u/μL)0.5 μL，T<,4> Buffer 2.5 μL，BSA(10 mg/μL)0.1 μL，HindⅢ(大連寶生物公司)3 U，Mse Ⅰ(NEB公司)3 U，HindⅢ adapter(50 μM)0.1 μL，Mse Ⅰ adapter(50 μM)0.1 μL，加ddH<,2>O至20 μL，37℃，酶切4 h：加入接頭后，8℃連接10 h以

6、上(或過夜)；連接產(chǎn)物稀釋5倍后進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增：預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋5倍后再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增；加5 μL Loading buffer，95℃變性10 min，立即冰?。辉?％變性聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分析；銀染法檢測PCR產(chǎn)物。 3．運(yùn)用擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)的方法，對獨(dú)特的雜交大豆試材進(jìn)行分析研究，通過比較Mse Ⅰ-HindⅢ、Mse Ⅰ-Pst Ⅰ、Mse Ⅰ-EcoR Ⅰ不同酶切組合的效果，結(jié)果表明Mse Ⅰ- Hind

7、Ⅲ較容易找到多態(tài)性引物組合，而且具有較高的多態(tài)性，本試驗(yàn)選用Mes Ⅰ-HindⅢ進(jìn)行雙酶切大豆線粒體DNA從而完成AFLP的分析工作，試驗(yàn)用64對Mse Ⅰ和HindⅢ引物對兩個(gè)不育系及保持系材料的線粒體DNA制成的pool進(jìn)行AFLP標(biāo)記分析，分析了不育系與保持系之間的多態(tài)性。 4．經(jīng)過初步篩選，選出10對能揭示出大豆細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與保持系線粒體DNA多態(tài)性的引物組合，多態(tài)性出現(xiàn)率達(dá)30％。 5．經(jīng)統(tǒng)計(jì)，用這10對