Cytophaga hutchinsonii遺傳操作體系的建立及應(yīng)用.pdf

1、工業(yè)革命大幅加速了人類文明前進的步伐，它的動力源泉是25億年前開始形成的不可再生化石資源。在過去的兩百多年里我們一直沉浸在它帶來的各種喜悅里。直到幾十年前，我們才逐漸意識到這些化石資源即將枯竭。同時我們還要不得不為自己以前的消費買單——治理環(huán)境污染，防止氣候繼續(xù)惡化。能源供應(yīng)問題直接關(guān)系到人類的生存和發(fā)展，還涉及到世界和平、社會穩(wěn)定。因此，尋找和開發(fā)環(huán)境友好的可再生資源已經(jīng)成為各國迫在眉睫的主要任務(wù)。太陽能是地球上生命的最重要的能量來源

2、，而生物質(zhì)是固定化的太陽能。生物質(zhì)能源儲量豐富，有廣闊的開發(fā)前景，每年全球植物光合作用生產(chǎn)的生物質(zhì)能總量大于一千億噸，僅陸地植物每年吸收固定的碳就有五百億噸。生物質(zhì)中最具開發(fā)價值的一部分是纖維素，它的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)條件溫和、綠色環(huán)保、產(chǎn)品多樣。然而其中存在的一個瓶頸問題是纖維素的酶解效率低，成本過高。而造成降解效率低的一個重要因素是纖維素中結(jié)晶區(qū)的難降解性。因此，結(jié)晶纖維素的高效降解是解決這一難題的關(guān)鍵。
　　 噬纖維菌（Cyto

3、phaga）廣泛存在于自然界中，它對結(jié)晶纖維素降解速度快，分解能力強，其模式菌株為CytophagahutchinsoniiATCC33406。哈氏噬纖維菌的結(jié)晶纖維素降解策略不同于已知的好氧真菌或厭氧細菌，菌體不分泌明顯胞外纖維素酶，表面也不存在纖維小體結(jié)構(gòu)，尚未得到闡明，參與降解的相關(guān)酶和蛋白尚缺乏研究。Wilson推測C.hutchinsonii存在第三種新型的結(jié)晶纖維素降解機制，對這種新型機制的闡明將會有助于對現(xiàn)有纖維素降解酶系

4、的改進和提高。然而對C.hutchinsonii的研究進展一直非常緩慢，主要原因是缺乏成熟的遺傳操作體系，難以進行遺傳改造，不能深入地進行機理研究。本文的主要內(nèi)容是以C.hutchinsonii為研究對象，建立一套可行的遺傳操作體系，并進一步用該技術(shù)對某些相關(guān)基因的進行敲除研究。這套遺傳操作體系的建立將為進一步揭示C.hutchinsonii未知的纖維素降解機制提供有力的工具.本文具體的研究內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　 1、C.hut

5、chinsonii的復(fù)制質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 質(zhì)粒是遺傳操作體系中不可缺少的工具，一些常用的廣宿主質(zhì)粒經(jīng)過嘗試均不能轉(zhuǎn)化進入并在C.hutchinsonii中獨立復(fù)制。本文利用C.hutchinsonii的基因組復(fù)制起點(oriC)和紅霉素抗性基因(ermF)構(gòu)建了一系列的復(fù)制質(zhì)粒。它們可以通過接合轉(zhuǎn)移或電擊轉(zhuǎn)化的方式，轉(zhuǎn)化到C.hutchinsonii菌體內(nèi)并進行復(fù)制。進一步對這些質(zhì)粒的性質(zhì)進行了研究，發(fā)現(xiàn)這些人工構(gòu)建的質(zhì)粒在C.

6、hutchinsonii菌體中的拷貝數(shù)非常低，常規(guī)方法提取的質(zhì)粒電泳不可見。Southern雜交結(jié)果顯示，含有較長復(fù)制起點DNA片段的質(zhì)粒更容易與基因組發(fā)生同源重組，含有標準長度復(fù)制起點DNA片段的質(zhì)粒以游離形式存在的概率較大。
　　 2、C.hutchinsonii電擊轉(zhuǎn)化技術(shù)的開發(fā)
　　 針對擬桿菌門遺傳操作體系開發(fā)的相關(guān)研究已經(jīng)實現(xiàn)了轉(zhuǎn)座子Tn4351通過接合轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)入C.hutchinsonii。但是接合轉(zhuǎn)化

7、的條件要求比較苛刻，程序復(fù)雜，實驗周期長，結(jié)果不穩(wěn)定?；瘜W(xué)轉(zhuǎn)化和電擊轉(zhuǎn)化的方法雖然簡單易行，但是并沒有成功的報道。本文利用自己構(gòu)建的oriC可復(fù)制質(zhì)粒，首次成功實現(xiàn)了對C.hutchinsonii的電擊轉(zhuǎn)化。經(jīng)過對培養(yǎng)條件和電擊參數(shù)素的優(yōu)化，初步確定了高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化條件:用PYG培養(yǎng)40小時的菌體制備感受態(tài)細胞，電擊參數(shù)采用12kV/cm、200Ω、25μF，電擊后復(fù)蘇4-8h，轉(zhuǎn)化效率可達到103cfu/μg質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化頻率達到10-5

8、。實驗室其他人員在此基礎(chǔ)上繼續(xù)優(yōu)化，已經(jīng)把轉(zhuǎn)化效率和頻率各提高了十倍，為進一步對C.hutchinsonii的遺傳改造創(chuàng)造了條件。
　　 3、C.hutchinsonii蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建
　　 目前C.hutchinsonii中已報道的可用的報告基因只有紅霉素抗性基因(ermF)，而報告基因的多樣性是一個完善的遺傳操作體系所必需的。在oriC復(fù)制質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建了可分別更換表達元件和報告基因的質(zhì)粒。擬桿菌的表達元件不同

9、與常見的E.coli的，據(jù)信息學(xué)分析C.hutchinsonii的啟動子而可能有保守的-33區(qū)和-7區(qū)序列，而不是-35和-10區(qū)，它的核糖體結(jié)合序列可能富含A，也不同于常見的RBS?；诒緦嶒炇业鞍捉M和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的相關(guān)研究，選取一批本底高表達基因的表達元件用于構(gòu)建表達質(zhì)粒，并更換了一系列的報告基因。最終與實驗室其他研究者共同發(fā)現(xiàn)了三個可用的報告基因:綠色熒光蛋白（gfp）、β-半乳糖苷酶(lacZ)和半乳糖激酶(galK)，(其他研究者

10、還發(fā)現(xiàn)cat和tetA也可用)。gfp和lacZ的優(yōu)點是直觀，易檢測定量，而galK作為反向篩選標記基因，可用于未來無痕敲除技術(shù)的開發(fā)。實驗中篩選到的高效啟動子(CHU_1284p)可以用于研究某些基因的過表達。另外，C.hutchinsonii的蛋白在E.coli表達系統(tǒng)進行異源表達困難一直很大，這或許與密碼子使用偏好性，蛋白折疊差異等相關(guān)。若能將這種質(zhì)粒開發(fā)為一種高效的表達載體，通過C.hutchinsonii表達自身的基因，便有可

11、能獲得易純化、有活性的蛋白。
　　 4、C.hutchinsonii基因敲除方法的開發(fā)
　　 C.hutchinsonii同源重組效率低，利用常規(guī)的自殺質(zhì)粒進行基因敲除非常困難。本文通過探索，建立了一種效率較高的單同源臂質(zhì)粒插入敲除的方法，它基于復(fù)制質(zhì)粒，通過兩步篩選得到敲除突變株。第一步，利用紅霉素抗性篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。因質(zhì)粒可以獨立復(fù)制，在菌體中存在的時間得到延長，重組到基因組的機會也相應(yīng)地增加。第二步，利用氯霉素抗

12、性篩選出敲除成功的突變子。質(zhì)粒上的氯霉素抗性基因（cat）處于同源臂的下游，cat的讀碼框前端僅含有一段C.hutchinsonii的SD序列，不含啟動子，所以游離的質(zhì)粒不能賦予轉(zhuǎn)化子氯霉素抗性。同源重組后，質(zhì)粒整合到目的基因上，中斷該基因，氯霉素抗性基因可以利用基因組上目的基因的轉(zhuǎn)錄元件進行轉(zhuǎn)錄，并通過自帶的翻譯元件進行獨立表達。本文用這種敲除方法獲得一批突變株，說明了它的高效性。
　　 5、應(yīng)用比較蛋白組學(xué)對C.hutchi

13、nsonii纖維素降解相關(guān)蛋白進行研究
　　 利用蛋白質(zhì)組學(xué)的手段，比較研究了以濾紙纖維素為唯一碳源和以葡萄糖為唯一碳源的條件下哈氏噬纖維菌全細胞蛋白的表達差異。差異表達蛋白的鑒定結(jié)果表明，以纖維素為唯一碳源時上調(diào)表達的蛋白質(zhì)主要涉及氧化應(yīng)激反應(yīng)和氨基酸合成代謝。對這些蛋白的分析發(fā)現(xiàn)，它們可能與生物膜的形成相關(guān)。通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)C.hutchinsonii在降解濾紙纖維素的時候均勻規(guī)則地排布在纖維素的表面，這很有可能就是一種

14、生物膜的形式。另一個值得思考的問題是氧化壓力的來源。褐腐菌被認為可以通過一種氧化機制降解木質(zhì)纖維素，在它產(chǎn)生有氧化能力的物質(zhì)的同時自身也必然會遇到氧化壓力。C.hutchinsonii氧化壓力來源是否也與氧化降解機制相關(guān)還有待探索研究。
　　 6、對一系列可能參與纖維素降解的基因進行敲除，并對突變株的相關(guān)性狀進行研究
　　 C.hutchinsonii是滑動細菌，其運動形式比較特殊，它沒有鞭毛、菌毛、纖毛等菌體表面附屬運

15、動器官，這種運動方式和Flavobacteriumjohnsoniae類似，可以在濕潤固體表快速滑動(gliding)，個體滑動是單菌落擴散(spreading)的必要不充分條件。信息學(xué)分析表明C.hutchinsonii具有全套滑動和擴散相關(guān)蛋白。最近的相關(guān)研究表明，這類蛋白在細菌表面的定位與一種新的Por分泌系統(tǒng)關(guān)系密切。研究人員猜測C.hutchinsonii在纖維素上降解時可能依靠這種滑動來“遷移覓食”。本文利用上面建立的敲除技

16、術(shù)對可能在纖維素降解中起重要作用的基因進行了敲除，主要包括一些擴散(spr)和分泌系統(tǒng)(por)相關(guān)基因。另外一些敲除目標是實驗室轉(zhuǎn)錄組中發(fā)現(xiàn)的相關(guān)基因，如與氨基酸合成和糖類運輸相關(guān)的基因等。以這些突變株為材料初步研究了它們的相關(guān)性狀，包括蛋白組分的變化、單菌落在瓊脂表面的擴散、對纖維素降解效率、對纖維素的吸附等。初步實驗結(jié)果顯示，纖維素降解和單菌落的擴散能力并沒有密切的相關(guān)性。
　　 本文構(gòu)建的遺傳操作體系為C.hutchin