DNA Shuffling技術(shù)提高干擾素比活性的研究.pdf

1、目的:DNAshuffling技術(shù)可以定向進(jìn)化干擾素，獲得比rhIFN-α2b標(biāo)準(zhǔn)品更高比活的干擾素。本實(shí)驗(yàn)利用DNase(I)酶切、無(wú)引物PCR、有引物PCR、目的基因與克隆基因pUC19連接、雙酶切鑒定，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞、陽(yáng)性克隆的篩選、測(cè)序正確的基因與表達(dá)載體pET30a連接、轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞以及誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白、細(xì)胞裂解、包涵體的純化、洗滌與裂解、目的蛋白的純化測(cè)活等一系列技術(shù)手段獲得比rhIFN-α2

2、b更高比活的干擾素。方法:rhIFN-α2b基因與Infergen基因用DNase(I)酶切成30-50bp小片段，回收之后進(jìn)行無(wú)引物PCR重聚和有引物PCR擴(kuò)增基因。將重組基因連接到載體pUC19中，轉(zhuǎn)化至DH5α并挑選陽(yáng)性克隆測(cè)序。將測(cè)序正確的突變基因連接到載體pET30a中并轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)中，誘導(dǎo)蛋白表達(dá)、SDS-PAGE凝膠電泳和Westernblot分析。經(jīng)過(guò)表達(dá)細(xì)胞誘導(dǎo)、細(xì)胞裂解、包涵體變性、復(fù)性和單克隆抗體親和層

3、析之后，最后獲得高純度與高活性的重組干擾素。結(jié)果:把10個(gè)連接到pUC19載體上的基因片段通過(guò)測(cè)序顯示7段載體上的基因沒(méi)有發(fā)生改變，分別是5段Infergen基因和2段rhIFN-α2b基因。3段基因序列發(fā)生了改變，包括2段基因發(fā)生了移碼突變，1段基因?yàn)檎Ｍ蛔兏蓴_素基因，對(duì)重組基因表達(dá)的干擾素測(cè)活得到的比活值為5.8×108IU/mg，而rhIFN-α2b標(biāo)準(zhǔn)品比活大約為1.2×108IU/mg，比活結(jié)果提高近5倍。結(jié)論:實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明