發(fā)酵產(chǎn)品干擾素

1、發(fā)酵產(chǎn)品---干擾素,,,,,,,,干擾素？,干擾素的價(jià)值干擾素應(yīng)用前景,干擾素是一種細(xì)胞因子，是目前所知機(jī)體發(fā)揮抗病毒作用最快的第一病毒防御體系，具有廣譜的抗病毒作用；抑制病毒感染、阻止病毒在體內(nèi)擴(kuò)散、促進(jìn)痊愈；調(diào)節(jié)免疫功能；抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)等作用。,,干擾素應(yīng)用前景,,重組人干擾素實(shí)現(xiàn)了干擾素在臨床上的廣泛應(yīng)用，用于慢性乙型肝炎、丙型肝炎以及腎癌、黑色素瘤、血液系統(tǒng)疾病等的治療。目前，國(guó)內(nèi)主要生物制藥企業(yè)正在積極研制長(zhǎng)效重組人干擾

2、素，重組人干擾素國(guó)內(nèi)市場(chǎng)仍有廣闊的發(fā)展空間，預(yù)計(jì)到2015年我國(guó)重組人干擾素市場(chǎng)規(guī)模將達(dá)到48億元左右。,,菌種來源: 重組人干擾素α-2b 工程菌是由帶有人α-2b 干擾素基因的重組質(zhì)粒[pVG3]轉(zhuǎn)化腐生型假單孢桿菌（pseudomonass putida VG-4）菌種而來,菌種的特性細(xì)胞形態(tài)：革蘭氏陰性，可運(yùn)動(dòng)，有莢膜，無(wú)芽孢，桿狀菌落特征： 灰綠色半透明狀。菌落之間結(jié)構(gòu)相同，具有黏稠性生化特性：菌株為蘇氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷

3、型，可以利用L-纈氨酸、DL-精氨酸和L-蘇氨酸作為碳源遺傳特性：細(xì)胞中攜帶pVG3質(zhì)粒，對(duì)氨芐青霉素有抗性生產(chǎn)能力： 具有生產(chǎn)干擾素a - 2b的能力,,干擾素α-2b的發(fā)酵工藝過程：,取保存工作種子批菌種，室溫融化搖瓶培養(yǎng)：30℃，pH7.0，250 r/min，18±2h檢測(cè)：OD值和發(fā)酵液雜菌檢查。,1.接種：接入50L種子罐，接種量10%。 2.培養(yǎng)：30℃，pH7.0。 3.控制：級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)

4、速4.DO為30%，3～4h，OD>4.0。 5.檢測(cè)：顯微鏡和LB培養(yǎng)基劃線檢查，控制雜菌。,1.接種：通入300L培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，接種量10%。2.控制：級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速。3.前4h：30℃，pH7.0，DO為30%。4.4h后：20℃，pH6.0，DO為60%，5～6.5h。5.終點(diǎn)控制：OD值達(dá)9.0±1.0，5℃冷卻水快速降溫至15℃以下。6.檢測(cè)：發(fā)酵液雜菌檢查,連續(xù)流離心機(jī)：冷卻的發(fā)酵液

5、，16000 r/min離心收集。菌體保存：－20℃冰柜，不超過12個(gè)月。檢測(cè)：干擾素含量、菌體蛋白含量、菌體干燥失重、質(zhì)粒結(jié)構(gòu)一致性、質(zhì)粒穩(wěn)定性。,,發(fā)酵中菌體生長(zhǎng)與干擾素合成的關(guān)系培養(yǎng)基組成溶解氧溫度pH值發(fā)酵過程中泡沫的形成與控制,(1)發(fā)酵中菌體生長(zhǎng)與干擾素合成的關(guān)系 在假單胞桿菌的發(fā)酵生產(chǎn)中，菌體在培養(yǎng)1.5h分裂速度最快，到3.5h開始下降。而干擾素的迅速合成出現(xiàn)在3.5h之后，在4h達(dá)到最大，然后由于降解

6、而迅速下降?？梢娫诎l(fā)酵生產(chǎn)工藝中，假單胞桿菌的生長(zhǎng)和干擾素的生產(chǎn)基本處于不相關(guān)狀態(tài)。,,(2)培養(yǎng)基組成 種子培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分宜豐富些，尤其是氮源的含量應(yīng)較高(即C/N低)。相反，對(duì)于發(fā)酵培養(yǎng)基，氮源含量應(yīng)比種子培養(yǎng)基稍低(即C/N高)。,,(3)溶解氧 基因工程菌發(fā)酵要求培養(yǎng)液中有足夠的溶解氧，為了提高發(fā)酵罐的供氧能力，往往需要增大攪拌轉(zhuǎn)速，增加空氣流量，或通入純氧,,(4)溫度 對(duì)于采用溫度控制

7、基因表達(dá)或質(zhì)粒復(fù)制的基因工程菌。發(fā)酵過程一般分為生長(zhǎng)和表達(dá)兩個(gè)階段。,,(5)pH值 采用兩段培養(yǎng)法，在生長(zhǎng)和生產(chǎn)階段分別控制在各自最佳pH值，對(duì)提高干擾素的發(fā)酵水平非常有利?？稍诎l(fā)酵后期降低pH值，從而造成大量蛋白酶失活，減少干擾素的水解，提高干擾素的積累量。,,(6)發(fā)酵過程中泡沫的形成與控制 氣泡內(nèi)的空氣有隔熱作用。造成培養(yǎng)及滅菌不徹底。泡沫多時(shí)會(huì)從排氣口甚至從軸封中溢出容易造成染菌。一般應(yīng)通過機(jī)械攪拌和加大少

8、量表面活性劑來消除泡沫。,,,干擾素α-2b分離工藝過程菌體裂解預(yù)處理初級(jí)分離,菌體裂解裂解緩沖液：純化水配制，2℃～10℃（pH7.5）使用保護(hù)劑：EDTA，PMSF。破碎-20℃菌體：2厘米以下的碎塊攪拌：加裂解緩沖液，2℃～10℃凍融: 細(xì)胞完全破裂，釋放干擾素。,預(yù)處理-沉淀加絮凝劑聚乙烯亞胺:2℃～10℃，攪拌45min，對(duì)菌體碎片進(jìn)行絮凝。加凝聚劑醋酸鈣溶液:2℃～10℃,攪拌15min，

9、對(duì)菌體碎片、DNA等進(jìn)行沉淀。,預(yù)處理-離心離心：2℃～10℃，16000 r/min收集上清液：含有重組干擾素蛋白質(zhì)雜質(zhì)沉淀：121℃、30min 蒸汽滅菌,焚燒處理。,初級(jí)分離鹽析: 加硫酸銨，2℃～10℃，攪勻,靜置過夜。離心：連續(xù)流離心機(jī)，16000 r/min保存：收集沉淀，粗干擾素，4℃保存。,干擾素純化工藝過程溶解粗干擾素沉淀除雜質(zhì)疏水層析無(wú)菌過濾分裝,溶解粗干擾素用超純水配制純化緩沖液。

10、在2～1O℃將粗干擾素倒入勻漿器中，加pH7.5磷酸緩沖液，勻漿，使之完全溶解。,沉淀除雜質(zhì) 待粗干擾素完全溶解后，用磷酸將溶液調(diào)至pH5.0，進(jìn)行蛋白質(zhì)等電點(diǎn)沉淀,疏水層析 干擾素吸附在疏水層析柱中 除去非疏水性蛋白 洗脫與收集：0.01M磷酸緩沖液（pH8.0）,,,,無(wú)菌過濾分裝0.