D-絲氨酸在鉛暴露致大鼠神經(jīng)損傷中的實(shí)驗研究.pdf

1、目的：本研究通過建立 D-絲氨酸（D-Ser）干預(yù)的鉛暴露大鼠模型，觀察大鼠海馬組織中 N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體表達(dá)、Ca2+濃度以及氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量等方面的變化，初步闡明D-Ser對大鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響機(jī)制。
　　方法：1實(shí)驗動物及分組：21天健康雄性SPF級SD大鼠60只，體重140-160g，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后隨機(jī)分為4組，分別為空白對照組（500mg/kg醋酸鈉）、鉛暴露組（500mg/kg醋酸鉛+隔日生

2、理鹽水注射）、D-Ser低劑量組（500mg/kg醋酸鉛+隔日30mg/kg D-Ser腹腔注射）、D-Ser高劑量組（500mg/kg醋酸鉛+隔日60mg/kg D-Ser腹腔注射）。采用自由飲水方式連續(xù)染毒8周。2應(yīng)用Morris水迷宮進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)測試。3應(yīng)用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）分析大鼠組織中鉛元素含量。4應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、海馬細(xì)胞Ca2+濃度以及活性氧（ROS）含量。5應(yīng)用 HE染色法觀

3、察大鼠海馬組織病理改變；6應(yīng)用尼氏染色法觀察大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞及結(jié)構(gòu)的變化。7應(yīng)用透射電鏡觀察海馬神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)的變化。8免疫組化方法觀察大鼠海馬組織中 NR2A蛋白、NR2B蛋白表達(dá)的變化。9應(yīng)用實(shí)時熒光定量 PCR方法測定海馬組織中NR2A蛋白、NR2B蛋白及絲氨酸消旋酶（Srr）mRNA表達(dá)變化。10高效液相色譜法測定海馬組織中4種氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)（谷氨酸 Glu、絲氨酸 Ser、甘氨酸Gly、γ-氨基丁酸 GABA）含量的

4、變化。11統(tǒng)計學(xué)分析實(shí)驗數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(x)±s）表示，各組間比較采用單因素方差分析（One Way ANOVA），兩兩比較采用LSD檢驗，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果：1、實(shí)驗大鼠的一般情況：在染毒期間，所有實(shí)驗大鼠攝食和飲水量未見異常。飼養(yǎng)過程中，實(shí)驗大鼠體重正常增長，各組體重增加變化無差異。2、D-Ser干預(yù)對鉛暴露大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響：Morris水迷宮實(shí)驗結(jié)果顯示，與對照組比較，鉛暴露組大鼠

5、的逃逸潛伏期增長（P＜0.05），穿臺次數(shù)下降（P＜0.05）；與鉛暴露組比較，D-Ser低劑量組與 D-Ser高劑量組大鼠的逃逸潛伏期降低（P＜0.05），穿臺次數(shù)增加（P＜0.05）。3、D-Ser干預(yù)對鉛暴露大鼠血液、海馬和皮質(zhì)中鉛含量變化的影響：與對照組比較，鉛暴露組大鼠海馬組織鉛含量是對照組大鼠海馬組織鉛含量的3.49倍；D-Ser低劑量組及D-Ser高劑量組大鼠海馬組織中鉛含量變化與鉛暴露組比較無差異（P＞0.05）。同樣，

6、D-Ser低劑量組與D-Ser高劑量大鼠皮質(zhì)、血液中鉛含量變化趨勢與海馬中鉛含量變化趨勢相同。4、D-Ser干預(yù)對鉛暴露大鼠海馬組織細(xì)胞凋亡的影響：鉛暴露組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞早期凋亡率、晚期凋亡率分別為25.40±4.44％、16.30±4.39%，高于對照組的16.70±5.79%、12.43±3.40%（P＜0.05）。D-Ser低劑量組大鼠海馬細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率分別為19.03±5.01%、11.02±2.55%，D-Ser

7、高劑量組大鼠海馬細(xì)胞早期凋亡率和晚期凋亡率分別為18.93±3.83%、12.93±2.28%，與鉛暴露組比較顯著下降（P＜0.05）。5、D-Ser干預(yù)對鉛暴露大鼠海馬組織 ROS含量的影響：鉛暴露組 ROS含量顯著高于對照組（P＜0.05）；D-Ser低劑量組、D-Ser高劑量組 ROS含量與鉛暴露組比較無統(tǒng)計學(xué)差異。6、D-Ser干預(yù)對鉛暴露大鼠海馬細(xì)胞 Ca2+濃度的影響：與對照組比較，鉛暴露組大鼠海馬細(xì)胞 Ca2+濃度增加，是

8、對照組的1.94倍（P＜0.05）； D-Ser低劑量組、D-Ser高劑量組大鼠海馬細(xì)胞 Ca2+濃度低于鉛暴露組，有顯著差異。7、D-Ser干預(yù)對鉛暴露大鼠海馬組織病理結(jié)構(gòu)的影響：光鏡下觀察可見，對照組大鼠海馬細(xì)胞完整，排列緊密規(guī)則；鉛暴露組大鼠海馬細(xì)胞排列紊亂，大量細(xì)胞死亡，表現(xiàn)為細(xì)胞核固縮、破裂。D-Ser低劑量組及 D-Ser高劑量組大鼠海馬細(xì)胞排列稍有紊亂，但細(xì)胞形態(tài)基本正常。尼氏染色顯示對照組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密、整齊

9、，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核核仁清晰。鉛暴露組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞排列疏松、紊亂，部分細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整。D-Ser低劑量組及 D-Ser高劑量組大鼠神經(jīng)元細(xì)胞排列稍有紊亂，少量細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整。透射電鏡結(jié)果顯示，對照組海馬神經(jīng)元細(xì)胞的細(xì)胞核飽滿，核膜光滑，染色質(zhì)分布均勻，髓鞘厚度和數(shù)量均正常。鉛暴露組海馬神經(jīng)元細(xì)胞的胞核皺縮、大量染色質(zhì)邊集；D-Ser低劑量組和D-Ser高劑量組海馬神經(jīng)元細(xì)胞有輕微的核皺縮和染色質(zhì)邊集現(xiàn)象。鉛暴露組、D-Ser低劑量組

10、和D-Ser高劑量組海馬神經(jīng)元細(xì)胞均有不同程度的細(xì)胞器數(shù)量減少、線粒體腫脹、髓鞘厚度變薄等現(xiàn)象。8、D-Ser干預(yù)對鉛暴露大鼠海馬組織中 NR2A和NR2B表達(dá)的影響：免疫組化結(jié)果顯示，鉛暴露組大鼠海馬組織中NR2A蛋白表達(dá)低于對照組（P＜0.05）；與鉛暴露組比較，D-Ser高劑量組大鼠海馬組織中NR2A蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。鉛暴露大鼠海馬組織中 NR2B蛋白表達(dá)變化與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義。海馬組織中 NR2A、NR2B及

11、Srr mRNA表達(dá)的變化：與對照組比較，鉛暴露組大鼠海馬組織中NR2A和Srr mRNA表達(dá)下降（P＜0.05）。D-Ser高劑量組大鼠海馬組織中 NR2A和Srr mRNA表達(dá)高于鉛暴露組（P＜0.05）。未見大鼠海馬組織中NR2B mRNA表達(dá)發(fā)生顯著性改變。9、海馬組織中氨基酸類神經(jīng)遞質(zhì)含量的變化：與對照組比較，鉛暴露組大鼠海馬組織中Glu含量顯著升高（P＜0.05），為對照組 Glu含量的1.26倍；與鉛暴露組比較，D-Ser