柱前手性衍生化高效液相法測(cè)定人血漿和尿液中的D-谷氨酸和D-絲氨酸.pdf

1、目的：人們很早已經(jīng)認(rèn)識(shí)到哺乳動(dòng)物體內(nèi)氨基酸的存在形式主要是L-型氨基酸，L-型氨基酸構(gòu)成各種活性蛋白質(zhì)分子和酶，發(fā)揮生理作用。但是近些年來隨著分析技術(shù)的進(jìn)步，人們對(duì)哺乳動(dòng)物體內(nèi) D-型氨基酸的發(fā)現(xiàn)和研究日益增多，迄今已經(jīng)發(fā)現(xiàn) D-絲氨酸、D-天門冬氨酸和D-蘇氨酸等，并且在此基礎(chǔ)上對(duì)D-氨基酸可能參與的生理、病理過程進(jìn)行了系列研究。研究發(fā)現(xiàn)，人腦內(nèi)D-絲氨酸的濃度與Alzheimer’s disease(阿爾茨海默病)，Parkinsi

2、ological disease(帕金森)，Schizophrenia (精神分裂癥)and renal diseases ect. (腎病)等疾病的發(fā)生和發(fā)展存在著直接或間接的關(guān)聯(lián)。因此，進(jìn)一步研究其他D-氨基酸是否(如D-谷氨酸)在人體內(nèi)與人體的成長(zhǎng)衰老之間存在某些相關(guān)性，這一切都使本文所做的研究具有重要的意義。 谷氨酸主要存在于腦中樞，是人體內(nèi)一種興奮性遞質(zhì)，參與興奮的傳遞，介導(dǎo)學(xué)習(xí)、思考、記憶、認(rèn)知和推理等智力活動(dòng)的過程

3、。在體內(nèi)，谷氨酸構(gòu)成的谷胱甘肽通過γ-谷胺酰循環(huán)參與其他多種氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收。谷氨酸是體內(nèi)聯(lián)合轉(zhuǎn)氨作用最重要的中介氨基酸?？梢哉f，谷氨酸是人體內(nèi)所有生理活動(dòng)中最活躍的氨基酸之一，其產(chǎn)生和作用的機(jī)制受到體內(nèi)激素(甾體激素類)的調(diào)節(jié)，并且與其他氨基酸的共同保持和維持多種體內(nèi)平衡。絲氨酸是在中樞神經(jīng)信息傳遞到達(dá)受體進(jìn)而產(chǎn)生效應(yīng)過程中一種內(nèi)源性遞質(zhì)。D-氨基酸作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)N-甲基-D-天門冬氨酸受體，后者在人正常生理和病理生理過程中具

4、有極其重要作用，如接受能力和精神分裂癥，腎病，腦缺血等。 現(xiàn)有氨基酸的分析測(cè)定的報(bào)道多數(shù)為應(yīng)用液相色譜(LC)，毛細(xì)管電泳或者氨基酸分析儀手性分離檢測(cè)生物體的 DL-谷氨酸和 DL-絲氨酸含量。尚未見D-谷氨酸與人年齡相關(guān)性的研究報(bào)導(dǎo)。本文通過建立了手性分離血漿和尿液中D-谷氨酸和D-絲氨酸的方法，對(duì)不同人群體內(nèi)D-谷氨酸和D-絲氨酸進(jìn)行了初步研究。 方法： 本文應(yīng)用柱前手性衍生化反相高效液相色譜法，鄰苯二甲醛(

5、OPA)和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)為柱前手性衍生化試劑，檢測(cè)器為熒光檢測(cè)器(FLD)，使用梯度洗脫程序，建立了手性分離包括DL-Glu和DL-Ser在內(nèi)19對(duì)氨基酸異構(gòu)體的方法，通過此方法，D-Glu和D-Ser異構(gòu)體可以完全分離，而不受其它氨基酸異構(gòu)體的干擾；然后在此基礎(chǔ)上建立手性分離血漿和尿液中D-Glu、D-Ser的方法，并應(yīng)用此方法測(cè)定不同年齡段，不同性別的正常人血漿和尿樣中的 D-谷氨酸和D-絲氨酸。 色譜柱：

6、大連依利特Htypersil C<,18>(4.6×150mm i.d.5μm，大連依利特分析儀器有限公司)；本研究使用流動(dòng)相包括兩種，流動(dòng)相Ⅰ：色譜純甲醇(A組分)；流動(dòng)相Ⅱ：50mmol/L NH4 Ac緩沖液(pH 6.0)(B組分)，梯度洗脫步驟：0-13min A組分為7％ B組分93％；13-40min A組分由7％降為4％ B組分升為96％；40-50min A組分為13％B組分87％；50-70min A組分90％B組分

7、10％。 紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：345nm 熒光檢測(cè)波長(zhǎng)：λ激發(fā)波長(zhǎng)350nm，λ發(fā)射波長(zhǎng)450nm 流速：1.0ml·min<'-1> 柱溫：室溫 進(jìn)樣量：20μL 結(jié)果： 以鄰苯二甲醛(OPA)和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)為柱前手性衍生化試劑，柱前手性衍生化反相高效液相色譜法成功手性分離了包括DL-谷氨酸和DL-絲氨酸在內(nèi)的19對(duì)氨基酸對(duì)映異構(gòu)體；在此基礎(chǔ)上建立手性分離血漿和尿液

8、中 D-谷氨酸和D-絲氨酸的方法；測(cè)定了不同性別和年齡的正常人體內(nèi)D-谷氨酸和D-絲氨酸的含量。通過研究發(fā)現(xiàn)正常人體內(nèi)D-谷氨酸的含量和年齡呈正相關(guān)。結(jié)果顯示，在血漿和尿液中方法的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于6％，在較寬的范圍內(nèi)峰面積與濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.9990。D-谷氨酸的最低檢測(cè)限為0.5ng,D-絲氨酸的最低檢測(cè)限為 0.6ng。實(shí)驗(yàn)證明本方法用于檢測(cè)血漿樣品中D-谷氨酸和D-絲氨酸具有專屬性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便快速、分離效果好、

9、準(zhǔn)確度高的特點(diǎn)。 結(jié)論： 建立以鄰苯二甲醛(OPA)和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)為手性衍生化試劑，柱前手性衍生化反相高效液相色譜法，手性分離了包括DL-谷氨酸和DL-絲氨酸在內(nèi)的19種氨基酸對(duì)映異構(gòu)體；在此條件下DL-谷氨酸和DL-絲氨酸可達(dá)基線分離，而且手性分離D-谷氨酸和D-絲氨酸不受其他氨基酸對(duì)映異構(gòu)體的干擾。通過文中建立的方法手性分離血漿和尿液中 D-Glu和D-Ser，檢測(cè)了正常人血漿中D-谷氨酸和D-絲