在線衍生高效液相色譜熒光檢測法測定血清犬尿氨酸和色氨酸及其臨床應(yīng)用.pdf

1、目的：1.建立一種簡單、快速的在線衍生高效液相色譜熒光法(HPLC-FLD)測定血清中的犬尿氨酸(KYN)。 2.建立同時(shí)檢測血清KYN和TRP的在線線衍生高效液相色譜熒光法。 3.初步探討測定血清KYN和TRP含量變化在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中的臨床意義。 方法：1.血清標(biāo)本與等量5％(V/V)高氯酸溶液混合處理去除蛋白后離心取上清液20μl直接進(jìn)樣分析。用HpersilC8色譜柱(300mm×6.0mm i.d.，1

2、0μm)分離；流動相為0.25 mol/L醋酸鋅及50 mmol/L醋酸溶液(含3％乙腈)，流速為1.5ml/min；熒光檢測激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為365nm和480nm。KYN經(jīng)流動相中的醋酸鋅在線熒光衍生后，用HPLC-FLD進(jìn)行測定。KYN峰采用峰保留值比較法和疊加法定性分析，用外標(biāo)法測峰面積進(jìn)行定量分析。同時(shí)探討了檢測波長、流動相種類、流動相中有機(jī)相的比例等因素對分離度和靈敏度的影響，考察了其它5種物質(zhì)對待測組分的可能干擾。

3、 2.在第一部分建立的方法的基礎(chǔ)上，調(diào)整檢測激發(fā)波長和發(fā)射波長，0-10 min熒光檢測激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為365nm和480nm，10 min后激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為254nm和404nm，實(shí)現(xiàn)KYN和TRP的同時(shí)測定，并對該方法進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)。 3.測定類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者(n=110例)血清KYN和TRP、初步探討其含量變化在鑒別診斷、治療監(jiān)測、機(jī)制研究等方面的臨床意義。分析血清KYN、TRP以及KYN/

4、TRP比值與疾病活動性分組、關(guān)節(jié)X線分期、關(guān)節(jié)功能分級、類風(fēng)濕因子(RF)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、血沉的相關(guān)性。 結(jié)果：1.血清標(biāo)本內(nèi)的KYN保留時(shí)間分別為8.1分鐘。KYN線性范圍為0.098～19.6μmol/L，最低檢測濃度為0.04μmol/L；回收率為90.8-96.2％，日內(nèi)CV為3.82％，日間為4.63％。苯丙氨酸(PHE)、酪氨酸(TYR)、犬尿喹啉酸(KYNA)、5-羥色胺(5-HT)和肌酐(Cr)在本文的色

5、譜條件下對KYN的測定均無干擾。 2.血清標(biāo)本的KYN和TRP均分離良好，保留時(shí)間分別為8.1和11.5分鐘。TRP的線性范圍為4.9～196μmol/L。最低檢測限為0.005μmol/L，回收率為92.6～106.9％，日內(nèi)CV為3.63％，日間為4.44％。上述5種物質(zhì)對待測組分KYN和TRP的測定均無干擾3.與正常對照組相比，RA組患者血清KYN含量顯著升高、TRP含量顯著降低；KYN/TRP比值與RF疾病活動度呈正相關(guān)

6、。 結(jié)論： 1.本文建立了在線衍生HPLC-FLD法測定血清KYN，方法簡單、快速、靈敏、特異、準(zhǔn)確，適宜于臨床與科研工作。 2.在第一部分的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)建立了在線衍生高效液相色譜—熒光檢測法能同時(shí)測定KYN和TRP，且該方法的精密度，準(zhǔn)確性，回收率，抗干擾能力，線性范圍等指標(biāo)均符合診斷實(shí)驗(yàn)的要求，具有進(jìn)樣量少、快速、靈敏度高、準(zhǔn)確度較高、特異性好的特點(diǎn)。 3.RA患者體內(nèi)存在為嚴(yán)重的犬尿氨酸代謝紊亂，且KYN